教育部科学技术研究重点项目简介

项目名称：新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus)抗冻蛋白基因的克隆及转基因结缕草抗寒性的研究项目编号：206170项目负责人：马春晖主要参加者：杨丽娟、李莲瑞、席琳乔、赖艳玲、罗振福等项目起止日期：2006年1月10日至2008年12月30日沙冬青起源于第三世纪，为亚洲中部荒漠地区     

PEG6000模拟干旱胁迫对2种沙冬青种子萌发的影响

以蒙古沙冬青和新疆沙冬青为材料,在不同浓度的PEG6000(0%、4%、8%、12%、16%、20%和24%)胁迫处理下,研究干旱胁迫对种子萌发和幼苗生长的影响,探讨经PEG6000处理后复水种子的萌发恢复能力。结果表明,随着PEG6000浓度的增加,蒙古沙冬青和新疆沙冬青的种子萌发率、发芽势、日相对发芽率受到不同程度的抑制,萌发进程推迟,胚芽长和胚根长也受到抑制,萌发种子含水量下降。总体来看,PEG6000浓度越大,各指标受抑制程度越明显,另外,在同等条件的干旱胁迫下,蒙古沙冬青受抑制程度小于新疆沙冬青。经PEG6000浸种处理的种子复水后仍具有较高的恢复萌发率,新疆沙冬青在24%PEG6000处理下无种子萌发,复水后萌发率较高。由此得出,蒙古沙冬青的抗旱性高于新疆沙冬青。     

西北荒漠地区超旱生常绿阔叶灌木--沙冬青

沙冬青是我国西北荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木树种，是第三代古地中海沿岸的植物，在古地中海退缩、气候旱化过程中幸存的残遗物种之一。沙冬青属仅有2种，一种是新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus)，仅见于新疆喀什地区南部昆仑山与帕米尔交界的狭窄地带。     

沙冬青AmDREB2基因的克隆及序列分析

DREB(Dehydration responsive element binding)蛋白属于植物AP2/EREBP(APETALA2/Ethylene-responsive element binding protein)类转录因子。我们通过表达谱分析,从强耐逆植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中鉴定出一个受寒旱诱导表达的DREB基因(命名为AmDREB2),并利用PCR方法克隆到其cDNA和gDNA,均由528bp组成,无内含子。推测其编码蛋白含158个氨基酸残基和1个保守的AP2结构域及核定位信号,很可能定位于细胞核。本论文为深入研究该基因的功能奠定了基础。     

温盐交互胁迫下蒙古沙冬青生长及生理响应特征

以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)幼苗为材料,设定3个温度梯度(20、30、40℃)和6个Na Cl质量分数梯度(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%)处理,测定温盐交互胁迫30 d下蒙古沙冬青幼苗株高变化、比叶面积、光合速率、叶绿素质量分数、水势、叶片相对含水量、可溶性糖质量分数和脯氨酸质量分数等部分生长及生理指标。结果表明,温盐交互作用,尤其是高温和高盐胁迫同时存在时会更显著地对植株正常生长造成抑制。温盐交互胁迫对蒙古沙冬青幼苗株高变化、比叶面积、光合速率、叶片相对含水量、叶片水势和脯氨酸质量分数产生极显著抑制作用,对叶绿素质量分数有显著抑制作用,对可溶性糖质量分数没有显著影响,且高盐比高温胁迫对指标变化量的影响更大。     

黄粉甲抗冻蛋白基因afp72 cDNA的克隆和序列分析

[目的]为抗冻蛋白基因afp72的体外表达和生物学功能研究奠定基础。[方法]从黄粉甲脂肪体中提取总RNA,通过RT-PCR克隆抗冻蛋白基因afp72,并构建克隆重组质粒pUCm-T-afp72。经双酶切后,将其与表达载体pMAL-p2X连接并转化到大肠杆菌TBI,构建表达重组质粒pMAL-p2X-afp72。[结果]afp72 cDNA长度为216 bpa;fp72的测序序列与GenBank中编码84个氨基酸的黄粉甲afps序列的同源性为89.48%a;fp72基因可能来自其他黄粉甲抗冻蛋白基因的突变或缺失;从蛋白水平上证实AFP72是一个抗冻蛋白,afp72是一个抗冻蛋白基因;表达重组质粒pMAL-p2X-afp72的构建是成功的。[结论]该研究为利用基因工程方法构建抗冻蛋白转基因植物提供了材料。     

蒙古沙冬青胰蛋白酶抑制剂基因AmTI的克隆及其功能分析

蛋白酶抑制剂(Protein inhibitors,PIs)是一类小分子多肽或蛋白质,在植物抵抗生物和非生物逆境中起中起重要作用.利用PCR方法从强抗逆植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中克隆到一个胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitors,TI8)基因AmT7,分析了其在非生物胁迫下的表达变化,构建了其植物表达载体.结果表明,AmTI的编码蛋白含197个氨基酸残基,分子质量为21.5kDa,在N端有信号肽序列,属于Kunitz型;在正常生长条件下,该基因只有微量的基础表达,但在脱水、低温和盐胁迫处理下,其表达量显著上调.本研究为进一步揭示AmTI的功能奠定了基础.     

强光和水分胁迫对沙冬青光呼吸的影响

[目的]研究沙冬青在强光和水分胁迫下其光呼吸的变化.[方法]采用LI-6400光合-荧光测定仪于5月份和10月份分别测定了沙冬青的光呼吸响应曲线、光呼吸/总光合响应曲线、光呼吸-NPQ响应曲线及10月份时沙冬青光呼吸速率和NPQ的变化特征.[结果]低光胁迫时光呼吸速率和光呼吸速率/总光合速率迅速增加,高光胁迫时两者缓慢变化,10月份沙冬青光呼吸耗能强于5月份,但对强光的敏感程度不及5月份;沙冬青光呼吸速率随NPQ的增加而增加,两者呈正相关曲线关系.水分饱和亏缺条件下,光呼吸速率的初始饱和亏缺大于NPQ.[结论]光呼吸和NPQ都是沙冬青重要的光破坏防御机制;光呼吸在沙冬青抗脱水能力中发挥着重要作用.     

光滑鳖甲Anatolica polita 抗冻蛋白基因的发育阶段性表达以及低温对其表达的影响

[目的]光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存.研究光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp)在不同发育阶段表达差异和冷胁迫对其表达的影响.[方法]通过实时定量PCR方法对Apafp752和Apafp914两种抗冻蛋白基因的mRNA水平变化规律进行了研究.[结果]随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8～9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7～8倍,蛹期时则显著降低.血淋巴液的渗透浓度值也呈现相同趋势.[结论]发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素.在低温胁迫下4～6龄幼虫afps的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫afps的累积.结合Apafps基因表达和低温存活率可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态.     

花粉管介导的准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白转基因棉花的筛选

利用新疆荒漠昆虫抗冻蛋白基因进行遗传转化是培育新疆棉花抗寒品种的新途径. 研究采用RT-PCR结合RACE技术从新疆荒漠昆虫准噶尔小胸鳖甲(Microdera puntip ennis dzungarica)中克隆获得抗冻蛋白(Antifreeze protein)基因Mp AFP149.将MpAFP149克隆至 pBI121上,获得重组质粒后采用电转化法将重组质粒转入农杆菌EHA105内,PCR筛选鉴定重组子,并测序确定抗冻蛋白植物表达载体构建正确.将pBI121-MpAFP通过田间的花粉管导入技术转化棉花,收取转化的棉花种子,经检测证明在转化10 000朵花中,卡那霉素抗性筛选出 13株,PCR检测有2株阳性植株.实验结果为进一步开展抗冻蛋白基因转化棉花的研究奠定了基础.     

沙冬青cDNA-AFLP体系的建立及引物筛选

[目的]建立适合于沙冬青cDNA—AFLP的反应体系。[方法]以对照、3种逆境处理的沙冬青为材料,采用Trizol法和改良CTAB法提取总RNA。[结果]改良的CTAB法可抽提到较高质量的总RNA,适于沙冬青总RNA的提取。采用EcoRI/MseI酶切体系,64对选择性扩增引物中有35对适合沙冬青cDNA-AFLP分析。[结论]该研究为利用cDNA-AFLP标记对沙冬青抗逆基因进行深入研究奠定基础。     

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。     

生长调节剂浸种对沙冬青种子萌发的影响

[目的]用不同生长调节剂浸种,对沙冬青种子进行了催芽研究。[方法]测定不同种类、不同浓度生长调节剂浸种后沙冬青种子的发芽率、发芽势、活力指数。[结果]在200~300 mg/L浓度范围内,不同浓度的生长调节剂(GA、NAA、IAA、IBA)对沙冬青种子发芽率、发芽势、活力指数均表现出促进作用。其中,200 mg/L GA能显著提高2种种源沙冬青种子的发芽率、发芽势、活力指数,宁夏银川种源分别较对照提高了28.0、46.7、10.1个百分点,内蒙呼和浩特种源分别较对照提高了26.0、48.0、11.4个百分点。[结论]内蒙古呼和浩特种源活力指数高于宁夏银川种源,生产上应首选。     

蒙古鲌对几种常用药物的敏感性试验

[目的]为蒙古鲌的科学用药提供参考,促进其养殖业的发展.[方法]对蒙古鲌进行了一些常用药物的敏感性试验.[结果]蒙古鲌对氯氰菊酯十分敏感,48 h TLM为0.072 mg/L,最低致死浓度范围为0.063～0.069 mg/L,安全浓度为0.021 6 mg/L.蒙古鲌鱼苗对甲苯咪唑、敌百虫、硫酸铜、强氯精、聚维酮碘均不敏感.以安全浓度为标准,蒙古鲌鱼苗对氯氰菊酯的敏感性大于辛硫磷.[结论]该研究可为更好保护和开发蒙古鲌资源提供依据.     

沙冬青容器播种育苗基质筛选研究

以沙冬青种子为材料,采用草炭土、秸秆粉、有机肥(鸡粪)、沙子不同比例配制成4种基质配方,以常用商业基质为对照,测定基质的理化性质如容重、总孔隙度、水气比以及pH值、电导率(EC)及沙冬青播种出苗率等指标,筛选沙冬青容器播种育苗基质配方。结果表明:配方4(T4,草炭土:秸秆粉:有机肥:素沙=1:2:2:1)培育的沙冬青幼苗的生物量、地径、根长及基质的pH值、EC值等均优于对照,同时该基质还具有较好的保水性和持水性。     

超临界CO_2萃取百里香油树脂及萃取物抑菌活性的研究

[目的]优化百里香油树脂的萃取工艺,并研究其萃取物的抑菌活性。[方法]采用超临界CO2提取百里香油树脂,并分别考察萃取压力、时间、温度等因素对萃取率的影响。同时对萃取的百里香油树脂进行抑菌活性研究。[结果]百里香油树脂最佳萃取条件为：萃取温度40℃,萃取压力25 MPa,萃取时间4 h。萃取物对供试菌金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和真菌白色念珠菌均有不同程度的抑制作用。[结论]百里香油树脂可望用于食品防腐剂或抑菌剂。     

百里香脂溶性化学成分研究

[目的]研究百里香中脂溶性化学成分。[方法]利用柱层析和薄层层析从百里香甲醇提取物及乙酸乙酯萃取物中分离初化合物,然后经1H-NMR、13C-NMR等现代波谱技术鉴定这些化合物的结构。[结果]从百里香甲醇提取物及乙酸乙酯萃取物中分离得到了4个化合物,分别为芝麻素(Ⅰ)、木栓酮(Ⅱ)、表木栓醇(Ⅲ)和β-谷甾醇(Ⅳ);其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均为首次在百里香植物中被发现。[结论]该方法研究了百里香中脂溶性化学成分,为百里香的进一步开发利用提供了理论依据。     

濒危植物矮沙冬青传粉生物学特性研究

[目的]阐明矮沙冬青的传粉机制,揭示影响矮沙冬青传粉成功的因素。[方法]以矮沙冬青的自然居群为研究对象,研究其花粉活力、柱头可授性、花药日散粉进程和传粉昆虫的种类、行为及访花频率。[结果]矮沙冬青花粉活力保持时间较长,I～9d内均能保持50％以上的花粉活力,0～8d内柱头均具有可授性,但柱头可授性下降很快,花后10d柱头丧失可授性：传粉昆虫主要为蜂类。昆虫的访花频率与植物的花药散粉进程高度吻合。花药日散粉、昆虫的传粉频率与环境温度密切相关、[结论]影响矮沙冬青传粉成功的因素主要有访花昆虫的数量、访花昆虫的访花频率和外界因素,     

沙冬青种子总黄酮对小鼠急性毒性作用研究

研究沙冬青种子总黄酮对小鼠的急性毒性作用,并测定沙冬青种子总黄酮单次给药的半数致死剂量(LD50)或最大耐受剂量(MTD).将70只体质量为(20±2)g的SPF级KM小鼠随机分成7组,雌雄各半,每组每只小鼠分别灌胃0.4mL的无菌生理盐水(对照组)及相同体积、不同浓度沙冬青种子总黄酮溶液,灌胃后7d内仔细观察小鼠的反应,观察并记录小鼠中毒症状和死亡数,利用改良寇氏法测定该总黄酮的LD50.试验结束后记录各组小鼠的体质量变化,进行病理剖检,同时每组随机取2只小鼠(雌雄各1只),分别采取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等进行病理组织学检查.结果表明:沙冬青种子总黄酮对小鼠的半数致死量LD50为2 004.47mg/kg,LD50的95%可信限为1 693.78～2 372.47mg/kg.死亡小鼠急性毒性主要表现为安静少动,即而出现走路不稳、腹卧昏睡、呼吸急促、连续性抽搐而死亡.说明小鼠在沙冬青种子总黄酮中毒后,心脏、肝脏、脾脏和肾脏等主要器官都受到一定程度的损害,但对小鼠的持续影响较小;沙冬青种子总黄酮毒性较低,符合低毒化合物标准(500～5 000mg/kg为低毒化合物).