卵丘细胞在卵母细胞体外成熟培养过程中的作用

介绍了卵丘细胞在卵母细胞体外成熟培养过程中的作用,主要从卵丘细胞与卵母细胞的结构与功能联系,卵丘扩展对卵母细胞体外成熟的影响及卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响三个方面加以阐述。     

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。     

甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟质量及卵丘细胞的影响

本实验旨在研究甘氨酸对卵丘细胞及卵母细胞体外成熟质量的影响,优化猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养体系。在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加6 mmol/L甘氨酸,体外培养至44 h后,通过倒置显微镜测量卵丘细胞扩散直径,结合流式细胞术与qPCR检测卵丘细胞凋亡情况;进一步检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽(GSH)、细胞成熟促进因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平及细胞成熟相关基因表达。结果表明:甘氨酸能显著提高卵丘细胞扩散直径,减少卵丘细胞的总凋亡率,并能显著提高卵丘细胞中Bcl-2的mRNA表达;甘氨酸能显著增加成熟卵母细胞中的GSH、MPF和MAPK水平以及成熟相关基因BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达。综上可知,甘氨酸可提高猪卵母细胞体外成熟质量,降低卵丘细胞凋亡率。     

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响

为探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的添加浓度及脱卵丘细胞时间对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响.试验通过在体外成熟液中添加不同浓度(0、10、15、20、30、40 ng/mL)的EGF来研究其对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响;在培养开始后的不同时间(18、24、38、44 h)进行脱卵丘细胞处理来研究不同时间脱卵丘处理对培养44 h的卵母细胞成熟率以及孤雌胚胎发育的影响.结果表明,成熟培养基中添加10 ng/mL EGF能显著提高卵母细胞的卵裂率和囊胚率(P <0.05).共培组和独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞成熟率均低于44 h,但差异不显著(P >0.05);共培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率和囊胚率显著高于培养44 h(P <0.05);独培组卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞的卵裂率与44 h无显著差异(P >0.05),但囊胚率显著高于培养44 h后脱卵丘细胞(P <0.05).添加10 ng/mL EGF对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育较好;卵母细胞培养18 h后脱卵丘细胞可提高孤雌胚胎早期发育能力.     

组织型纤溶酶原激活剂基因在牛卵丘-卵母复合体体外成熟进程中的表达

为了初步了解组织型纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator,tPA)在牛卵丘－卵母复合体体外成熟进程中的潜在作用,试验运用实时定量RT-PCR技术分别检测体外成熟过程中不同时间段(0、8、16、24 h)以及添加不同浓度FSH成熟培养16 h后的牛卵丘细胞和卵母细胞中tPA基因相对表达变化,观察添加不同浓度FSH成熟培养16 h后卵丘细胞膨胀程度差异,并统计卵母细胞第一极体排出情况。结果显示,卵丘－卵母复合体在体外成熟初期,tPA mRNA相对表达水平在体外成熟16和24 h的卵丘细胞和卵母细胞中显著高于0和8 h组;在添加不同浓度FSH (0、0.01、0.1和1 IU/mL)体外成熟16 h的各处理组,卵丘细胞中tPA mRNA相对表达量随FSH添加浓度的升高而升高,卵丘细胞的扩散程度亦随之增加;同时tPA mRNA相对表达量在0.01 IU/mL FSH添加组卵母细胞中显著高于其他各FSH添加组。综合以上研究结果,本研究认为,牛卵丘细胞中tPA基因的表达受FSH正向调节;tPA可能促进了卵丘细胞在体外成熟过程中的扩散;同时,tPA在卵母细胞中的表达是否与其第一极体排出有关,需进一步试验验证。     

牛体外受精胚胎培养技术研究

在COCs体外培养过程中添加共培养物质和采用不同体积的液滴进行培养,以探讨牛卵母细胞的体外培养效果。结果表明,卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育均有促进作用,其中以卵丘细胞+bFF共培养系统对桑椹胚和囊胚的发育最好,其囊胚率为10.63%,显著高于对照组的7.23%(P<0.05),高于卵丘细胞组的8.50%(P>0.05)。用培养皿微滴培养(50μL)和用4孔板大体积培养(500μL)的试验表明,大体积培养比微滴培养有优势,桑椹胚和囊胚率均较高,其中囊胚率为10.23%,显著高于培养皿微滴培养的9.07%(P<0.01)。     

影响哺乳动物卵母细胞体外成熟的主要因素

卵母细胞体外成熟培养技术是哺乳动物体外受精技术的重要环节之一,是应用促性腺激素和类固醇激素在体外模拟卵泡的环境,进而诱发卵母细胞成熟的一项生物技术。主要影响因素如下:1卵母细胞类型在卵母细胞体外成熟研究中,一般根据卵母细胞周围包绕卵丘细胞的情况,分为四种类型,A类:由致密多层卵丘细胞包裹的卵母细胞;B类:卵丘细胞层不完全的卵母细胞;C类:完全裸露的卵子;D类:卵丘细胞呈蜘蛛网状附着的卵母细胞。即包绕三层以上紧密卵丘细胞的卵母细胞为第一类;三层以下的为第二类;卵丘细胞扩展而疏松,卵母细胞卵质无斑块的为第三类;无卵丘细…     

牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

试验以牛卵泡内卵丘-卵母细胞复合体(COCs)为材料,探讨了牛卵丘细胞包裹程度对卵母细胞体外成熟(IVM)和孤雌胚胎(PAEs)发育的影响。试验1,将COCs随机分为2组,在开展IVM前,将其中一组COCs的卵丘细胞机械吹打去除成为机械裸卵(DOs),研究卵丘细胞层存在与否对卵母细胞体外核成熟(排出第一极体)和孤雌激活后发育能力的影响;试验2,根据COCs卵丘细胞包裹层数将COCs分为3组,即卵丘细胞层少(1～4层)的COCs为A组、卵丘细胞层多(5层以上)的COCs为B组及包裹5层以上卵丘细胞且附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs为C组,研究卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞的体外核成熟和孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:卵丘细胞的存在更有利于卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育;COCs中卵丘细胞包裹层数对卵母细胞体外核成熟率没有显著影响,但包裹卵丘细胞层数多且附带FSP的卵母细胞,其PAEs的囊胚率显著高于包裹卵丘细胞少的卵母细胞PAEs。     

水牛卵丘细胞和颗粒细胞单层对卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

[目的]探讨卵丘细胞对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及颗粒细胞单层对水牛体外胚胎发育的影响。[方法]①按卵母细胞有无卵丘细胞情况分为五个组：即自然裸卵组（Ⅰ组）、自然裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅱ组）、人为裸卵＋卵丘细胞共成熟组（Ⅲ组）、AB级卵母细胞成熟后去除卵丘细胞受精组（Ⅳ组）、AB级卵母细胞对照组（Ⅴ组）分别进行体...     

卵丘细胞与卵母细胞解离对小鼠卵子体外成熟及受精的影响

卵丘细胞与卵母细胞的解离会降低小鼠卵母细胞的成熟质量,该研究将解离所得裸卵用不同种成分明确的成熟培养液进行体外成熟、体外受精、体外发育,从而确定卵丘细胞与卵母细胞的解离对小鼠卵母细胞成熟、受精、发育的影响,并通过筛选建立起最优的试验体系,为去除卵丘细胞的卵母细胞体外成熟质量的提高及后续研究提供参考依据。结果显示,裸卵的成熟率与成熟培养液的选择密切相关,TYH组、HTF组极显著优于M199组、α-MEM组;卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对受精率的影响是巨大的,解离后(10%～28%)与解离前(48%～76%)差异极为显著(P<0.01);卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对发育率的影响未发现显著差别(P>0.05)。因此,卵丘细胞与卵母细胞的解离主要影响了小鼠卵母细胞的体外受精率,通过选用适当的培养液可以相对改善该情况。     

白藜芦醇对体外培养的水牛卵丘细胞增殖活力及其相关基因mRNA表达的影响

[目的] 研究白藜芦醇（resveratrol,RES）对水牛卵丘细胞体外培养过程中细胞增殖活力、激素分泌、卵丘扩展及抗凋亡和抗氧化能力的影响。[方法] 用不同浓度（0（对照组）、1、10、20、30、40、50和60 μmol/L）RES培养卵丘细胞,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖活力,筛选最佳RES处理浓度及时间用于后续试验。用ELISA法测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇（estradiol,E₂）和孕酮（progesterone,P₄）的含量,实时荧光定量PCR法测定卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因的相对表达量。[结果] 与对照组相比,在体外培养24~36 h内,1、10和20 μmol/L RES组水牛卵丘细胞的增殖活力均有升高趋势,10 μmol/L RES处理36 h细胞活力最强,因此用于后续试验中细胞的处理。体外培养36 h时,10 μmol/L RES组细胞增殖能力和E₂、P₄的分泌显著增加（P<0.05）;10 μmol/L RES组卵丘细胞扩展相关基因穿透素3（PTX3）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）基因mRNA相对表达量显著或极显著增加（P<0.05;P<0.01）,而促凋亡基因Bcl-2相关蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和p21的表达量显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）,透明质酸合酶2（HAS2）和过氧化氢酶（CAT）的表达量无显著差异（P>0.05）。[结论] 培养液中添加10 μmol/L RES能够提高水牛卵丘细胞体外培养的增殖活力,促进卵丘细胞激素分泌和卵丘细胞扩展,并增强卵丘细胞抗氧化能力并减少细胞凋亡。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的初步探讨

主要探讨无卵丘水牛卵母细胞体外成熟的可行性,以便为研究卵母细胞成熟机理提供模型。无卵丘的水牛卵母细胞随机分为5组,然后分别进行直接成熟培养（M1）,与卵丘细胞单层共培养（M2）,用未扩展的卵丘细胞块包围培养（M3）,与扩展的卵丘细胞团共培养（M4）和用卵巢组织包围培养（M5）。无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟培养24 h后检查第一极体（PB1）排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活,评定其成熟质量。结果发现,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其它各组间没有显著差异（P〉0.05）;M5组的孤雌激活卵裂率显著低于M1组和M4组（P〈0.05）,而与M2组和M3组没有显著差异（P〉0.05）,但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组（P〈0.05）。这些研究结果表明：（1）未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟,但与卵丘细胞单层共培养没有作用;（2）卵巢组织包围培养不利于水牛卵母细胞的体外成熟。     

新鲜和冷冻猪卵子体外成熟培养对纤溶酶原激活物存在的影响

对体外成熟培养不同时间段猪的新鲜和冷冻的卵子中是否能够释放纤溶酶原激活物(PAs)的情况进行了研究。被卵丘细胞包裹的卵子取自于囊状卵泡,用NUSU-23培养液进行体外培养。OPS冷冻法冷冻卵子。在成熟培养液的卵丘细胞通过用细管不断地吸吐的方法去除。用SDS和酶谱法对猪的卵丘卵母细胞和裸卵里的纤溶酶原激活物进行密度测定。结果显示:在猪新鲜的卵丘卵母细胞中能够检测出Upa、tPA和tPA-PAI。体外培养24h后,在裸卵中也可以检测出uPA的活性;体外成熟培养48h后,在卵丘卵母细胞中能够检测出tPA和tPA-PAI,但在裸卵中没有检测出PAs。在所有冷冻组的试验中,没有检测出PAs活性。     

奶牛卵丘细胞无血清体外培养液的优化

采集奶牛卵巢表面卵泡中的卵丘-卵母细胞复合物,通过胰蛋白酶消化获得卵丘细胞,分别利用对照组DMEM/F12培养液和4个试验组McCoy's5a培养液对卵丘细胞进行原代及传代培养.试验1组用McCoy's5a基础培养液,试验2组在McCoy's5a基础培养液中添加29 ng·mL-1的睾酮,试验3组同时添加29 ng·mL-1的睾酮和15μmol·L-1的绿茶多酚,试验4组在第3组基础上添加转铁蛋白(5 μg·mL-1)、硒(5 ng·mL-1)和胰岛素(10μg·mL-1),构建成优化培养液(Optimized McCoy's5a).结果表明,试验4组优化培养液所培养的卵丘细胞的形态和增殖规律符合正常细胞的一般规律,染色体核型正常,其细胞内SOD、GSH含量及冷冻解冻后的存活率均显著高于对照组,优化培养液可以代替含血清的DMEM/F12培养液用于奶牛卵丘细胞的体外培养.     

GM-CSF对猪卵丘细胞扩展相关基因表达的影响

试验旨在研究猪卵母细胞体外培养过程中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对卵丘细胞的影响。在成熟培养液不变的情况下添加10μg/L和100μg/L的GM-CSF,对卵丘卵母细胞复合体(COC)分别培养12、24、48 h,运用CCK8检测试剂盒检测卵丘细胞活性。收集培养48 h的COC,观察卵丘细胞扩展情况,统计卵母细胞极体排出率。结果显示,GM-CSF对卵母细胞极体排出率无显著影响,但有助于3～4级卵丘细胞的扩散。100μg/L的GM-CSF作用48 h,能够极显著提高卵丘细胞的细胞活性(P0.01)。研究表明,100μg/L的GM-CSF可促进COC中3～4级卵丘细胞的扩展。     

BMP15对绵羊卵丘细胞扩展相关基因及激素受体基因表达量的影响

为探究添加骨形态发生蛋白15(BMP15)对绵羊卵丘细胞体外培养扩展相关基因及激素受体表达量的影响,本实验采集健康绵羊离体卵巢,分离卵丘-卵母细胞复合体收集卵丘细胞进行体外培养,分别在培养液中添加终浓度0、25、50、100、200 ng/mL的BMP15,以0 ng/mL为对照组,采用Real-time PCR方法检测BMP15处理的卵丘细胞中扩展相关基因(HAS2、PTGS2、PTX3)及激素受体基因(FSHR、E_2R、LHR)的表达水平。结果表明:相较于对照组及其他浓度处理组,添加100ng/mLBMP15极显著提高了HAS2、PTGS2、PTX3和FSHR、E_2R、LHR表达量。推测BMP15能够促进绵羊卵母细胞体外培养过程中卵丘细胞扩展,添加BMP15不仅能够上调FSHR、E_2R、LHR的表达,还能促进卵丘细胞激素分泌。     

猪不同直径卵泡内卵母细胞胞质成熟及体外发育潜力差异原因的初探

试验根据直径将猪卵泡分为2组:G1组(4~7 mm)和G2组(2~4 mm),对2组卵泡内获取的卵母细胞体外成熟率和发育潜能进行了比较,利用相对定量PCR检测了卵丘细胞中卵丘扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31及Pgr的表达水平,应用绝对定量PCR检测了成熟培养前后卵母细胞线粒体拷贝数,并利用5,5'-二巯基-2-硝基苯酸(DTNB)酶循环法检测了体外成熟培养过程中卵母细胞谷胱甘肽(GSH)的含量。结果显示,G1组和G2组卵母细胞体外成熟率分别为95.06%和68.19%,G1和G2组排出第一极体的成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚率分别为51.47%和29.44%,2组卵母细胞在体外成熟率和孤雌发育率上均差异显著(P<0.05)。G1组卵丘细胞在体外成熟培养过程中的扩展程度明显高于G2组,G1组卵母细胞对应的卵丘细胞扩展相关基因Has2、Ptgs2、Ptx31、Pgr的表达水平高于G2组(Has2基因在卵母细胞成熟培养0、24 h除外);G1组卵母细胞线粒体数、谷胱甘肽含量均高于G2组。以上结果表明,大卵泡来源的卵母细胞体外成熟能力和发育潜力优于小卵泡来源的卵母细胞,这可能与卵母细胞成熟过程中卵丘扩展程度、卵丘扩展相关基因表达激活情况、卵胞质内谷胱甘肽含量和线粒体拷贝数有关。     

山羊GDF9基因在卵丘卵母细胞复合体体外成熟过程中的表达

本研究采用实时荧光定量PCR技术,从mRNA水平探讨了山羊卵丘卵母细胞复合体体外成熟(IVM)过程中(0、6、12、18、24和27h)GDF9基因的相对表达变化,分析其与卵丘细胞扩散之间的关系。结果表明,GDF9 mRNA在山羊卵丘卵母细胞复合体体外成熟过程中均有表达,且在成熟培养初期表达量较低,其表达峰值出现在IVM12h,与卵丘细胞开始扩散的时间一致,之后又有所下降。由此推测,GDF9基因在山羊卵丘扩散和卵母细胞体外成熟过程中起着重要的作用。     

生长激素对体外培养猪COCs影响的研究

研究了生长激素对猪COCs体外成熟过程中卵丘细胞扩展、卵丘细胞凋亡、卵母成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:生长激素(STH)能够促进卵丘细胞扩展,抑制卵丘细胞凋亡,对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应。在猪COCs培养液中添加0.15μg/mL STH成熟率(73.83%±1.80%)和卵裂率(64.76%±2.84%)显著高于对照组(mNCSU-23+PMSG(10IU/mL)+hCG(10 IU/mL))及添加0.01、0.05、0.1、2μg/mL STH组(P<0.05),在本实验中为猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。     

卵母细胞成熟相关激素和生长因子受体在马扩展型和紧凑型卵丘-卵母细胞复合体表达的研究

旨在比较一些与卵细胞成熟相关的激素和生长因子受体在两种卵丘-卵母细胞复合体(Ex-COC和Cp-COC)中的表达以探究两种类型的马卵母细胞成熟和发育能力差异的原因。本研究在屠宰场采集蒙古马离体卵巢带回实验室回收COCs,并根据卵丘细胞形态区分Ex-和Cp-COCs;通过qPCR和免疫荧光检测FSHR、LHR、IGF1R、IGF2R、ESR1、ESR2,BMP15和GDF9受体BMPR1B、BMPR2和ALK5在两种COCs中的表达模式;将雌二醇、IGF2、GDF9和BMP15分别添加进马IVM培养体系中检测其对马卵母细胞体外成熟率的影响。结果显示,这些受体基因的表达量在Ex-和Cp-COCs的卵丘细胞和卵母细胞中均有差异,在Cp-COCs中,卵丘细胞的大部分受体基因表达量高于卵母细胞;而在Ex-COCs中,卵母细胞与卵丘细胞的基因表达水平相似或高于卵丘细胞。相较于Cp-COCs的卵母细胞,大部分的受体基因在Ex-COCs的卵母细胞中表现出更高表达水平。体外成熟培养试验表明雌二醇和IGF2的添加可能有利于提高马的卵母细胞体外成熟率。马扩展型和紧凑型COCs中FSH、LH、IGF1、IGF...