山西冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分析了山西100份小麦品种(系)Waxy蛋白的缺失类型,筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料8份。利用2个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定,验证其在分子标记辅助育种中的有效性,结果表明:Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条450 bp的特异带,而在缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中扩增出1条327 bp的特异带;Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带,缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段;Wx-7A,Wx-7D位点的SSR引物在野生型中分别扩增出1条265 bp和1条204 bp的特异带,在缺失Wx-A1和Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这3个标记可以用于分子标记辅助育种。     

大豆7S球蛋白α-亚基缺失型种质创新

采用常规杂交育种方法,人工去雄、授粉,以10份综合农艺性状优良的黑龙江省主栽品种(或优良品系)为母本、亚基组成为(α'+α+11S酸性亚基)-缺失型育种材料日B为父本进行有性杂交。将F1杂交种南繁,单粒点播、单株收获得到F2代分离群体。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法分析表明,F1代杂交种子7S球蛋白α'-与α-亚基的表现型全部为正常型。在杂交F2代种子中获得了具有中国大豆遗传背景的α-缺失、(α+A1aA1bA2)-缺失、A3-缺失、(α'+A4)-缺失和(α'+α)-缺失的贮藏蛋白亚基组成新类型种质,为我国大豆蛋白组分育种选择提供了重要的中间材料。     

利用特异PCR引物进行分子标记辅助选择的研究

利用与抗白粉病基因相连锁的RAPD分子标记和控制1 Dy 10基因序列的特异PCR引物对贵农775的杂交组合后代进行了分子标记辅助选择.在50株F2植株中,初步筛选到具有抗白粉病基因标记和5 10亚基特异标记的9株;有抗白粉病基因标记和2 12亚基特异标记的24株;有抗白粉病基因标记,同时具有5 10亚基和2 12亚基特异标记的5株.本研究说明分子标记是检测抗病基因和辅助选择育种的有效手段.     

我国部分小麦地方品种Waxy基因多样性研究

利用2对STS引物、1对SSR引物和1对基因特异引物分析了1739份中国小麦地方品种Waxy基因的变异情况。检测出Wx-Al基因缺失突变材料3份，Wx-Bl基因缺失突变材料25份，Wx-Dl基因缺失突变材料3份。利用SDS-PAGE方法对以上Waxy基因突变材料在蛋白质水平上进行鉴定，验证了Waxy分子标记在种质资源研究中的有效性。向育种家推荐一批具有不同Waxy基因缺失的地方种质，并提供了全部品种的缺失类型。     

水稻中脉缺陷突变体dl-6的遗传分析与精细定位

为了克隆DL-6基因,以dl-6与9311配制正反杂交组合进行性状分析发现,dl-6突变性状受1对隐性核基因控制,利用SSR分子标记将控制dl-6性状的基因DL-6初步定位在水稻第3染色体的短臂上,进一步利用新发展的InDel标记将DL-6基因精细定位在I3-5和I3-8之间85 kb的物理距离内。对该区段内存在的开放阅读框( ORF)进行分析,发现其中ORF9编码的YABBY基因是一个与叶脉发育相关的基因,对突变体dl-6和野生型中YABBY基因进行测序,将测序结果与数据中日本晴序列进行比对发现,突变体dl-6中YABBY基因的第1个外显子存在1个单碱基突变,该突变导致野生型中编码的半胱氨酸突变为突变体中的精氨酸;同时突变体dl-6在YABBY基因的3′端还存在8个碱基的缺失。这2个突变位点哪个是导致dl-6突变的功能区目前还不确定,有待进一步研究。     

玉米缺陷型籽粒突变体的遗传分析及突变基因dek1-T7的定位

突变体是功能基因组学研究和分子育种的重要材料。自然条件下,在玉米自交系M08649中发现一个突变穗,其突变表型表现为凹陷,没有胚以及胚乳,不能发芽并繁殖后代的缺陷型籽粒(defectivekernel)。利用出现籽粒突变自交系M08649的杂合体与正常自交系齐319构建分离群体对突变体进行遗传分析,共有85个F2代自交穗具有突变籽粒,38个F2代自交穗表现为正常,统计分析发现其符合2:1的分离比例。同时在85个具有突变籽粒的穗子中,共有9961粒正常籽粒和3217粒突变籽粒,符合3:1的分离比例,初步证实自交系M08649中控制籽粒发育的突变基因属于单个基因的隐性突变,暂命名为dek1-T7(t)。利用SSR分子标记将该基因初步定位在第1染色体的短臂上1.03区,位于SSR标记bnlg2204和Hkf1-3之间,两个标记之间的物理距离为1.78Mb。本研究结果为该基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

小麦回交后代中1 Dx 5+1 Dy 10优质亚基的分子检测

利用高分子量麦谷蛋白亚基1 Dx5、1 Dy 10的PCR分子标记,对贵农21与加拿大小麦Neepawa的BC1F2 100个单株进行了分子标记辅助选择.结果表明,具有1 Dx5和1 Dy 10亚基的亲本Neepawa和BC1F2代单株中可扩增出1 Dx5(450 bp)和1 Dy 10(576 bp)特异带,具有12亚基的单株扩增出612 bp特异带;在100个单株个体中,共检测到具有5+10优质亚基的5株,占5%;有2+12亚基的34株,占34%;同时具有5+10和2+12亚基的4株,占4%;并发现了新的组合类型5+12亚基,占57%.利用分子标记辅助选择技术,结合回交选育,可以在较早世代鉴定小麦优质亚基组合,选育出具有亚基组合新类型的小麦优质品系,为小麦的优质育种快速提供选育材料,从而提高选择效率,加快育种进程.     

水稻咪草烟抗性的遗传分析及其紧密连锁分子标记的筛选与应用

抗除草剂水稻的培育及推广能够提高除草效率, 取得巨大经济效益。本研究中金粳818为抗咪草烟资源, 以其与常规粳稻苏垦118杂交产生的F₂群体对抗性基因进行遗传分析与分子定位表明, 其抗性表型受1对显性核基因控制, 位于水稻第2染色体SSR分子标记RM7413和RM7426之间。对该区间候选基因预测和测序发现, 咪草烟靶基因-乙酰乳酸合酶基因(ALS)在重要功能位点发生1个碱基的突变(G变为A), 导致一个氨基酸由丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N), 初步确定ALS是抗性表型的重要候选基因。标记RM7413、RM7426与ALS的物理距离分别为165 kb、1612 kb。以金粳818与南粳9108为亲本, 检测标记RM7413在辅助育种实践中的应用潜力, 对杂交种及其自交后代进行连续表型及标记选择, F₇群体能够稳定遗传抗咪草烟性状, 表明RM7413在粳稻抗咪草烟辅助育种中具有巨大应用潜力。本研究结果为粳稻抗除草剂分子标记辅助改良奠定了基础。     

运用关联分析定位栽培大豆蛋白11S、7S组分的相关基因位点

大豆贮藏蛋白主要成分是7S和11S球蛋白,大豆贮藏蛋白组分及其亚基组成决定了蛋白质的品质和加工特性。本研究选用134对细胞核SSR标记,对166份栽培大豆微核心种质进行基因分型,运用一般线性回归(general linear model, GLM)和复合线性回归(mixed linear model, MLM)方法进行标记与性状的关联分析,定位大豆蛋白亚基的相关基因。结果表明,2年均检测到的且与蛋白亚基相关联的SSR位点有14个,以MLM方法检测到5个SSR位点(Sat_062、Satt583、Satt291、Satt234和Satt595)与蛋白亚基相关联;7S组分各亚基变异程度较大,是引起11S/7S变异的主要原因;表型变异较大的亚基可能因为相关基因进化中发生重组较多,LD衰减距离较小,导致检测到较少的相关位点。本研究结果对蛋白亚基相关性状的标记辅助选择育种有重要的利用价值。     

甘蓝型油菜花叶性状的遗传及基因定位

为明确甘蓝型油菜花叶性状的遗传特点,开发与花叶性状连锁的分子标记。以甘蓝型油菜品系2205(圆叶)、1423(花叶)为亲本,构建了3个世代群体:F1、BC1和F2,探讨花叶性状的遗传规律;利用分子标记技术对花叶基因进行定位。结果表明,F1植株叶形表现为花叶,BC1(F1×2205)和F2中花叶与圆叶的植株分离比分别符合1∶1和3∶1,说明甘蓝型油菜的花叶性状受1对不完全显性基因控制。利用集团分离法(BSA)筛选637对SSR引物,共筛选到了3个与花叶基因紧密连锁的SSR标记:CB10079、BNGMS114和BNGMS385。连锁分析发现,这3个连锁标记均位于花叶基因的一侧,其中BNGMS114与花叶基因的遗传距离最近,其遗传距离为2.5 c M。将这3个连锁标记的序列与白菜基因组的序列进行比对,结果发现它们与白菜A10染色体的序列共线性较好,花叶基因位于A10染色体的15.70 Mb下游区段。上述标记的获得为油菜花叶性状的分子标记辅助选择育种以及花叶基因的克隆奠定理论基础。     

基于BSA-Seq技术挖掘大豆中黄622的多小叶基因

The leaves of cultivated soybean (Glycine max L.) are comprising of three leaflets in general, but there are also individual varieties or mutants which have a high frequency of compound leaves with 4-7 leaflets, named multifoliolate leaves. Compound leaf formation enhances the plant's ability to adapt to the external environment. Study of related genes to multifoliolate leaves might contribute to the improvement yield level of and soybean agronomic traits. In this study, a multifoliolate leaf mutant Zhonghuang 622 was identified from the mutant library of soybean cultivar Zhongpin 661, which had 4-9 leaflets in each compound leaf. The compound leaf phenotypes of F₂ and F_2:3 population from a cross between Zhongpin 661 and Zhonghuang 622 were investigated in Beijing and Hainan, respectively. Analysis of phenotypic data from F₂ and F_2:3 population revealed that the multifoliolate leaf trait was controlled by an incomplete dominant gene. BSA-Seq method was used for gene mapping. The two bulks of normal trifoliate and multifoliolate individuals in F₂ population were constructed and sequenced for an average depth of 32.75×, which covered 99.22% genome compared to the reference genome. Through correlation analysis of mixed pool sequencing results by ED method, two regions were located on chromosome 11, with a total length of 5.29 Mb and a total length of 1103 genes. Three regions were identified on chromosome 11 at confidence of 0.99, with a total length of 3.42 Mb and a total of 701 genes by the association analysis of SNP-index method. There were 690 genes located simultaneously and six SNP genes between parents by the two association analysis methods. These results lay the foundation for map-based cloning of the genes related to compound leaf development.     

野生和栽培大豆种质油脂组成特点及其与演化的关系

以58份不同类型(野生、半野生和栽培)大豆种质为材料,利用32对SSR标记分析大豆种质间的遗传多样性和进化关系,采用NIRS和GC方法分别分析大豆脂肪含量和脂肪酸组分含量,研究不同类型大豆种质油脂组成特点及其与演化的关系。结果显示,野生大豆和栽培大豆的油脂组成存在显著差异,栽培大豆脂肪含量(平均20.8%)显著高于野生大豆(平均10.49%),油酸含量(平均28.5%)显著高于野生大豆(平均14.37%),而亚麻酸含量却显著低于野生大豆;由相关性分析可知,大豆种子中的脂肪与油酸含量显著正相关(r=0.85**),而与其他脂肪酸组分极显著负相关;油酸与所有其他脂肪酸组分均负相关,特别是与亚麻酸和亚油酸呈极显著负相关(r=?0.90**和?0.89**);油脂组成和SSR标记对不同类型大豆种质的聚类和主成分分析表明,2种分类结果基本一致,可分为栽培和野生2个亚群,半野生大豆则分布于2个亚群中。由此可见,大豆油脂组成与大豆种质的驯化程度有关,脂肪含量和亚麻酸含量可以作为大豆演化分类的参考指标。     

利用SSR方法鉴定大豆品种纯度

本研究以遗75—14，中黄14，中品662和中品661共4个品种为试验材料，利用不同连锁群上的SSR引物对其随机选择个体进行分析，以确定分析品种纯度所需的引物数，为大豆品种资源的保存及品种指纹图谱的建立提供理论依据。通过11对SSR引物对遗75—14，中黄14，中品662各10个单株的检测，发现中品662纯度最高，遗75～14次之，而中黄14的纯度最低。用SSR引物对中品661和中品662每10个单株混合样品分析并经单株检测验证，其纯度分别为99．0％和98．3％，研究结果表明，10个植株混合时，即使有一个单株为杂合位点也能被检测出来，并发现用3—5对位于不同连锁群的SSR引物可以对随机或混合样品进行快速、准确的纯度鉴定。     

大豆亲本间遗传距离与杂种优势的相关性研究

为提高杂交育种效率,有必要对杂种优势预测进行探索。本研究选用国内外不同地区10份材料,按NCⅡ不完全双列杂交法组配45个杂交组合,利用SSR分子标记遗传距离预测大豆亲本间杂种优势。结果表明：10份亲本中检测到417个多态性等位基因变异,多态性位点变化范围为2~5个,遗传相似系数(GS)变幅为0.520~0.695,平均GS值为0.5996。10份供试材料被分为两大类,F₁杂种优势值从3.4%~42.1%,F₁性状均具有不同程度正向杂种优势。其中,单株粒数杂种优势与遗传距离的相关系数为0.461,达显著水平。其余8个农艺、品质性状与遗传距离的相关系数未达显著水平。初步认为,利用该174个SSR分子标记检测亲本间遗传差异,对本研究10份大豆亲本间杂种优势预测效果不显著。利用分子标记遗传距离预测大豆亲本杂种优势的方法有待进一步研究。     

用3种方法定位玉米萌发期和苗期的耐盐和耐碱相关性状QTL

以耐盐碱郑58和盐碱敏感昌7-2为亲本,构建包含151份F2:5重组自交系(RILs)群体。基于3K芯片对郑58、昌7-2及其F2:5家系进行基因型分析,构建了包含1407个SNP分子标记的高密度遗传连锁图谱。该图谱的各染色体标记数在84～191之间,标记间的平均距离为0.81 cM。胁迫液为200 mmol L–1 NaCl和100 mmol L–1 Na2CO3,对照液为蒸馏水或霍格兰营养液,对盐、碱胁迫和自然条件下玉米的发芽率(GP)、株高(PH)、植株干、鲜重(FW、DW)、幼苗组织含水量(TWS)、植株地上部分钠含量(SNC)、钾含量(SKC)、钠/钾含量比(NKR)、苗期耐盐率(STR)、耐碱率(ATR)10项指标,采用3种不同的作图方法同时定位研究,对加性QTL定位采用复合区间作图法(CIM)和完备区间作图法(ICIM),对加性QTL与环境互作联合分析采用混合线性模型的复合区间作图法(MCIM)。结果表明,(1)与对照条件下各性状表型值相比,耐碱相关性状的降低较耐盐相关性状明显,说明玉米对碱胁迫更加敏感和碱胁迫对玉米的伤害更严重。碱与盐胁迫下SKC相当而SNC差异较大,表明Na+、K+的吸收和运输是相互独立的两个过程,玉米盐、碱胁迫可能是两种性质不同的胁迫。(2)在自然、盐和碱胁迫条件下,运用CIM分别检测到27、28、40个加性QTL;运用ICIM分别检测到28、23、17个加性QTL;运用MCIM共检测到11个耐盐加性QTL、4个环境互作QTL以及11个耐碱加性QTL、3个环境互作QTL。(3)盐胁迫条件下的qPH-9、qSTR-8、qNKR-6、qNKR-7和碱胁迫条件下的qPH-9、qATR-3能被3种作图方法重复检测到。与前人结果比较, qPH-9、qSTR-8、qNKR-6、q-ATR-3定位在相同或邻近区域,qNKR-7尚未见报道。本研究结果为精细定位玉米耐盐碱主效基因、挖掘候选基因和开发用于标记辅助选择的实用功能标记奠定基础。     

一个新的玉米Vp15基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

在玉米繁种过程中发现一个玉米穗发芽突变体(viviparous), 命名为vp-like4。经过连续多代自交发现该突变体性状能稳定遗传, 并且表现为隐性单基因控制。以vp-like4与自交系Mo17杂交构建F₂遗传定位群体, 利用BSR-Seq方法, 将目的基因定位于玉米第5染色体173.8~175.6 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现, 在此定位区间内存在一个已报道的Vp15基因。Vp15基因编码钼喋呤合酶小亚基, 参与类胡萝卜素裂解为ABA的过程。利用2个独立的vp15突变体vp15-umu1和vp15-DR1126的杂合体, 分别与vp-like4突变体杂合体做杂交进行等位测验, 发现杂交后代中正常籽粒与穗发芽籽粒比例符合3∶1分离比。基因组序列分析发现vp-like4突变体中Vp15基因在第2外显子末端及3°非翻译区有60个碱基的缺失, 与所报道的vp15突变体vp15-umu1、vp15-DR1126均在第2个外显子有Mutator转座子插入的突变方式不同。进一步通过RT-PCR检测发现, vp-like4突变体中Vp15基因的表达量显著降低。以上实验证据表明, vp-like4是一个新的Vp15基因等位突变体。     

大豆GmHDL57基因的克隆及抗盐功能鉴定

HD-Zip I类转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要功能, 本研究克隆得到1个大豆HD-Zip I类基因GmHDL57 (Glycine max homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明, GmHDL57基因包含1个1038 bp的开放读码框, 编码345个氨基酸, 具有HD-Zip类家族蛋白典型的保守结构域。基因时空表达分析表明, 大豆GmHDL57基因在大豆植株的各个不同时期及不同器官中均有表达, 在花中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术分析了4种非生物胁迫(脱落酸、NaCl、PEG、冷)对幼苗期大豆根中GmHDL57基因表达的影响。结果表明, 该基因表达量受高盐胁迫诱导显著升高, 在脱落酸及干旱胁迫下上升幅度较小, 但在冷胁迫下呈下降趋势。盐胁迫前后GmHDL57基因在根中的表达量明显高于茎和叶, 在盐胁迫48 h时达到峰值, 72 h和96 h时表达量缓慢下降。此外, 构建GmHDL57基因的植物超表达载体, 利用根癌农杆菌转化法获得转基因百脉根, 200 mmol L ^-1 NaCl处理条件下, 转基因百脉根的株高、根长、叶绿素含量、根系活力以及阳离子K ⁺、Ca ²⁺含量显著高于野生型, 而丙二醛含量、相对质膜透性以及Na ⁺的含量明显低于野生型。以上研究结果表明, GmHDL57基因参与了大豆对非生物胁迫的应答过程, 过量表达GmHDL57基因能够显著提高百脉根的抗盐能力。     

一个新的玉米silky1基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

前期试验发现一个玉米雄性不育突变体(male sterile mutant),命名为msm-6。经过连续多代杂合单株自交发现该突变体性状能稳定遗传,遗传模式分析表明该突变体为单个隐性1核基因控制。以msm-6与自交系B73杂交构建F2遗传定位群体,利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法,筛选到与msm-6位点连锁的4个SSR标记,即C6-24、C6-30、C6-34和C6-40。进一步采用444个F2单株对这4个连锁标记验证,将msm-6定位于标记C6-24与C6-34之间,即玉米第6染色体68.5～98.1 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现,在此定位区间内存在一个已报道的Silky1基因。Silky1基因编码MADS-BOX蛋白,是参与花器官建成ABCD模型的B功能基因,该基因的突变会造成雄花不育、雌花花丝增多等表型。利用杂合体+/silky1-mum3与纯合突变体msm-6/msm-6杂交进行等位测验,杂交后代中正常植株与突变植株分离比例符合1∶1。基因组序列以及转录本序列分析发现,msm-6突变体中第6个内含子5'端供体位点AG/GTAAG (外显子/内含子交接处)的序列+1位G突变为C,导致第6外显子被错误剪切掉,产生了第6个外显子缺失的Silky1异常转录本。以上实验证据表明,msm-6与所报道的由mutator转座子插入造成的Silky1突变体silky1-mum2、silky1-mum3和silky1-mum4的突变方式不同,是一个新的Silky1基因等位突变体。msm-6的发现与鉴定为进一步深入解析玉米穗花器官决定的遗传机制提供丰富的实验材料,同时也为RNA加工过程中剪接位点保守性提供重要证据。     

玉米雄性不育突变体mi-ms-3的遗传分析及分子鉴定

Maize is one of the best crops in the utilization of heterosis. Male sterile lines are important germplasms for the hybrids production. A male sterile mutant named mi-ms-3 was obtained by screening in a mutator insertion library. The number of male anthers in tassel decreased and not exserted. There were few anthers with only two pollen sacs in the mutant tassels, and some of the anthers were degenerated to membranous and formed filaments at their ends. Although pollens in the anthers could be stained by I₂-KI, pollen shedding was abnormal and the number of pollen grains decreased. The number of silks in the ear of the mutant increased, and there was a sterile grain on both sides of the maturated kernel. Fertility of F₁ plants, which were obtained by hybridization between mi-ms-3 and maize inbred Mo17, was normal. Genetic analysis of F₂ population showed that the mutant phenotype was controlled by a recessive gene. The candidate gene was preliminarily mapped on the long arm of chromosome 3 by BSA and it was located between a SSR marker and an Indel marker with a distance of 1.5 cM. There are 21 candidate genes in this region. It was finally found that the insertion mutation of Mu transposon occurred at 30 bp upstream of the coding region of zm00001d042618 (zmm16) by transponson tagging and sequencing analysis. The results showed that mi-ms-3 was a new allele of sts1, which caused by a single base mutation in the coding region. RT-PCR analysis indicated that the expression of zmm16 in the mutant was decreased. The identification of the new allelic mutant of sts1 in this study would provide new materials for the study of flower development and hybrid seed production.     

玉米穗发芽突变体vp-like8的遗传分析及突变基因鉴定

玉米突变体vp-like8具有明显的穗发芽性状且能稳定遗传,遗传分析表明该突变性状受隐性单基因控制。用vp-like8与自交系郑58杂交构建F2遗传定位群体,利用BSR-Seq方法,将基因初定在玉米第3染色体160.4 Mb～165.6Mb区间内。参考玉米基因组信息,发现已报道的穗发芽基因Vp1位于此定位区间内。分别利用vp1、vp-like8的杂合突变体进行等位测验,发现杂交后代中正常与穗发芽籽粒符合3∶1遗传分离比。经序列分析,发现vp-like8突变体中Vp1基因在第2内含子有343 bp碱基的缺失,且第3内含子有222 bp重复序列的插入,而已报道的vp1突变体只在第2个内含子有343 bp碱基的缺失。通过实时定量PCR检测发现,与正常籽粒相比, vp-like8与Vp1突变籽粒中Vp1基因的转录水平均明显降低。以上证据表明, vp-like8是一个新的Vp1基因等位突变体。