拟南芥木聚糖合成关键酶基因的调控研究

【目的】从目前已知的参与拟南芥Arabidopsis thaliana次生壁加厚生长的转录因子着手,分析这些次生壁相关的转录因子是否能够调控木糖合成关键酶基因FRA8、IRX9、IRX10、IRX14、F8H、IRX9-L、IRX10-L和IRX14-L的表达,并且观察KNAT7基因显性抑制植株的表型.【方法】通过Gateway技术构建效应器和报告器,进行瞬时转录激活试验,同样构建pCAMBIA1304-p35S∷KNAT7-SRDX重组质粒,用农杆菌Agrobacterium tumefaciens花序浸染法将此质粒转化到野生型拟南芥植株中.【结果和结论】瞬时转录激活试验表明,转录因子KNAT7、MYB46、ERF72、SND1、NST2能够激活多个拟南芥木聚糖合成关键酶基因的表达,其中KNAT7能促进基因FRA8、IRX9和IRX14-L的表达.KNAT7基因显性抑制能显著影响拟南芥的生长.试验结果表明KNAT7基因可能在木聚糖的合成中起着重要的调控作用.     

DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b对银腺杨‘84K’生长发育的影响

  目的  DNA拓扑异构酶基因是一类能够改变DNA拓扑结构的酶，在基础生命活动如DNA复制、转录、有丝分裂等过程中发挥重要作用。研究DNA拓扑异构酶基因对杨树Populus生长发育的影响，能够进一步了解DNA拓扑异构酶基因在木本植物中的作用机制，评估其是否可作为林木分子育种的靶标。  方法  从银腺杨‘84K’ Populus alba × P. glandulosa ‘84K’ (84K杨)中克隆得到DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b，利用生物信息学方法对其进行序列分析、蛋白理化性质及结构分析。实时荧光定量PCR分析PagTOP2b在杨树不同组织中的表达水平。利用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的叶盘转化法转化84K杨，得到PagTOP2b过表达转基因植株。通过表型及茎段切片分析过表达PagTOP2b基因对84K杨植株生长的影响。  结果  以84K杨cDNA为模板，克隆得到PagTOP2b基因全长序列，该基因蛋白质编码区(CDS)长度为4 449 bp，编码1 482个氨基酸，根据蛋白结构域分析属于ⅡA型DNA拓扑异构酶。PagTOP2b主要在杨树幼嫩组织中有较高的表达量。过量表达PagTOP2b基因会导致转基因植株高度、基部节间直径和木质部宽度显著增加。  结论  DNA拓扑异构酶作为一类参与基础生命活动的重要功能酶，在杨树中过量表达ⅡA型DNA拓扑异构酶基因PagTOP2b可促进植株的纵向及径向生长，增加植株生物量。图4表1参28     

花楸树热激蛋白SpHSP70-3基因克隆与功能分析

  目的  探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用,以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。  方法  以2 ~ 4年生花楸树实生苗为研究对象,进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究,并利用农杆菌介导法转化拟南芥,对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。  结果  SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp,编码695个氨基酸;SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示:SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高,在花蕾、初花、盛花时表达量偏低;42 ℃处理花楸树后,发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化,12 h时表达量增至对照组的12倍,24 h时表达倍数最高,为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45 ℃高温处理后,OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT,且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外,SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升,并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达,同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。  结论  SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用,初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。      

青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

  目的  USPs蛋白（universal stress proteins）是一类胁迫相关类蛋白,被广泛报道参与了植物应对非生物胁迫的过程。本研究通过对青杄中PwUSP1基因进行功能分析及验证,探索PwUSP1在植物应对盐和干旱胁迫时的作用,从而为未来通过转基因工程提高青杄对非生物胁迫的耐受性提供候选基因。  方法  通过瞬时转化烟草叶片实验揭示PwUSP1在细胞中的定位;利用酵母双杂实验鉴定PwUSP1自身能否形成同源二聚体;通过农杆菌侵染法转化野生型拟南芥（WT）,获得纯合的PwUSP1过表达株系。通过测定干旱和盐胁迫下过表达株系（L1、L7）及野生型（WT）和空载体（VC）株系的存活率、失水率,来分析比较不同株系对于干旱和盐胁迫的耐受能力;通过二氨基联苯胺（DAB）和氯化硝基四氮锉蓝（NBT）染色,测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的含量,研究PwUSP1发挥作用的生理机制。  结果  烟草亚细胞定位实验表明,PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。酵母双杂结果显示PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。利用qRT-PCR检测转基因拟南芥,成功获得两个稳定纯合的株系（L1、L7）进行进一步分析。在盐和干旱胁迫下,相对于WT和VC,过表达PwUSP1能够显著提高植物对盐和干旱的耐受能力,表现出更高的存活率和更低的失水率,且显著降低了植株中过氧化氢、超氧阴离子的累积,提高了SOD、POD和CAT活性,抑制了MDA的积累。  结论  青杄PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中且自身能够形成同源二聚体,在干旱和盐胁迫条件下,PwUSP1通过增强植物的ROS清除能力及抑制膜脂氧化损伤来提高植物对非生物胁迫的耐受性。      

白桦木质部原生质体初生细胞壁再生过程转录组分析

  目的  木质部细胞壁的组成及特性是决定材性的重要因素,研究木质部细胞壁形成的分子调控机制对于木材改良具有重要意义。本研究探究了白桦木质部原生质体初生壁再生过程的分子调控机制,并鉴定出重要调控基因,旨在为林木材性性状研究提供数据和材料。  方法  分别以培养0 h和2 h的白桦木质部原生质体为材料,通过荧光增白剂染色观察初生壁再生过程。利用转录组分析技术研究初生壁再生前后的差异表达基因及其参与的调控途径,将检测到的差异表达基因在GO、KEGG、PlantTFDB数据库中进行比对分析。  结果  荧光显微镜观察结果显示:原生质体分离后不具有细胞壁,培养2 h再生初生细胞壁。以|log₂（FC）| ≥ 1（FC为差异倍数）且q < 0.05为标准筛选差异基因,结果显示:相较于刚分离的原生质体,培养2 h的原生质体中检测到4 396个上调表达的基因,4 056个下调表达基因,总计8 452个差异表达基因。其中GO数据库共注释到10个显著上调条目,KEGG数据库注释到10个显著差异代谢通路,PlantTFDB数据库共注释到16个家族的360个差异表达转录因子。GO注释结果表明,DNA复制、细胞周期相关基因上调表达。KEGG注释结果表明,谷胱甘肽、α-亚麻酸等与抗逆代谢相关的基因下调表达,果胶脂酶相关基因上调表达。PlantTFDB注释结果表明,bHLH、NAC、MYB、bZIP等与细胞壁合成密切相关的转录因子均差异表达。  结论  培养2 h的木质部原生质体处于细胞壁再生及分裂准备状态,DNA复制、细胞周期、多糖合成代谢等相关基因在白桦木质部原生质体培养及初生细胞壁形成过程中起调控作用。      

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子（NAC secondary wall thicking promoting factor）调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNST CDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素（GA3）,水杨酸（SA）和多效唑（PCB）诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST 的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成（60.83 %）;三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高（49%—55.9%）,并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平（12h）分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素（13%）、总糖（7%）和木质素（11.7%）含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因（PAL,4CL等）及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

山楂中木质素合成调控转录因子MYB46的克隆及功能鉴定

模式植物拟南芥AtMYB46在次生壁形成过程中充当纤维素、木质素和木聚糖生物合成基因的转录调节因子,其表达受植物特异性转录因子NAC家族成员的调控。然而,果树次生壁生物合成的调节机制在很大程度上尚不清楚。从山楂(Crataegus pinnatifida)中分离克隆得到与拟南芥和苹果中MYB46具有高度保守R2R3 MYB DNA结合结构域的MYB46编码基因,并将其命名为CpMYB46。通过农杆菌介导的转化方法分别在拟南芥、烟草和苹果中异位表达CpMYB46基因。异位表达CpMYB46基因的拟南芥和烟草的次生壁过量沉积而导致生长受到限制,表现出株型矮小和叶片上卷的表型。定量RT-PCR数据表明,CpMYB46基因可以调控转基因植株次生细胞壁生物合成中下游基因的表达,茎切片观察表明异位表达CpMYB46明显增加了转基因拟南芥、烟草和苹果木质部中次生壁厚度。EMSA实验结果表明其上游NAC家族成员CpSND1可以直接结合CpMYB46基因的启动子。研究揭示了CpMYB46在DNA结合结构域与拟南芥和苹果中的MYB46具有高度保守性,而且在植物次生壁合成调控中也存在功能保守性。研究为揭示山楂内种皮中木质素的合成提供了分子依据,也为山楂的分子育种奠定了基础。     

枣果胶甲酯酶基因家族鉴定及基于RNA-Seq表达分析

  目的  果胶是植物细胞壁的主要成分和结构多糖。果胶甲酯酶（PME）是一种重要的果胶修饰酶,具有调节细胞壁弹性和通透性的作用,在植物的生长发育过程中发挥作用。本研究探讨枣果胶甲酯酶基因家族的基本信息和特点,为进一步阐明ZjPMEs基因的功能、筛选果实质地密切相关基因奠定基础。  方法  本研究基于‘冬枣’基因组,鉴定枣基因组中的果胶甲酯酶基因;基于RNA-Seq数据,分析枣果胶甲酯酶基因家族的特征以及表达模式。  结果  共鉴定出46个枣果胶甲酯酶基因,不均匀分布在10条染色体上。系统演化分析表明这些基因包含29个Type- Ⅰ型和17个Type- Ⅱ型成员,进一步可以划分为4个亚家族。在每个亚家族中,基因共享保守的基因结构和基序组成。基因表达分析显示该家族基因在花中表达丰度较高,可能在枣的生殖发育过程起重要作用。通过分析该家族基因在不同质地的‘冬枣’（酥脆）和‘P15’（硬质）以及在不同用途的‘冬枣’（鲜食）和‘骏枣’（制干）果实发育过程中的表达模式,筛选出与枣果实质地关系密切的基因ZjPME 18,该基因在‘P15’和‘骏枣’果实中表达量较高。  结论  枣果胶甲酯酶基因家族具有特定的结构特征及表达模式,ZjPME 18的表达与调控可能与枣果实质地密切相关。      

拟南芥抗菌核病突变体275-7的初步研究

草酸是核盘菌致病过程中产生的毒素因子。以菌核病菌毒素草酸（3 mmol/L）为筛选压,从1 000个拟南芥T-DNA插入突变体中筛选出了1个草酸不敏感突变体,命名为275-7。通过拟南芥活体接种对突变体275-7进行菌核病抗性鉴定,与野生型相比,突变体275-7对菌核病的抗性显著增强（P<0.05）;荧光定量PCR检测结果表明,275-7中茉莉酸途径的标志基因PDF1.2的表达量是野生型的12倍,而水杨酸途径的标志基因PR1基因的表达量与野生型比较无差异。推测拟南芥突变体275-7可能通过增强水杨酸介导的防卫反应,从而表现出对菌核病的抗性。     

毛竹茎秆快速生长期PeATG1/PeATG4基因表达分析

  目的  探讨毛竹Phyllostachys edulis茎秆快速生长与PeATG1和PeATG4基因表达的关系。  方法  以毛竹笋竹茎秆为材料,采用透射电镜监测笋竹快速生长期不同时间（10:00、14:00、18:00、22:00、2:00和6:00）和不同部位（第4、7、10、13节）的自噬活性,并用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析技术测定第7节PeATG1和PeATG4基因表达量。  结果  对毛竹茎秆24 h自噬活性监测,22:00和2:00在第7节和第10节观察到自噬体;第4节和第13节没有观察到自噬体。在夜间,PeATG1和PeATG4转录水平表达增强,PeATG1表达量在22:00最高,分别是18:00和6:00的3.0倍和1.3倍（P < 0.05）;PeATG4表达量在2:00最高,分别是18:00和6:00的1.7和1.6倍（P < 0.05）。  结论  毛竹茎秆不同时间段的生长发育存在显著差异,夜间有自噬体形成,PeATG1和PeATG4基因表达量较高,茎秆生长迅速。     

巨桉EgrCIN1响应非生物逆境的分析

  目的  对巨桉Eucalyptus grandis中特有的低温响应基因EgrCIN1 (Eucgr.B02882)序列及其表达特征进行分析,并探索其在植物低温响应中发挥的功能,以丰富桉树抗寒基因资源。  方法  利用生物信息学手段分析EgrCIN1基因、蛋白序列的特征和启动子上的顺式作用元件信息;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析EgrCIN1在巨桉不同组织及4 ℃不同时间、干旱、300 mmol·L?1氯化钠(NaCl)、100 μmol·L?1脱落酸(ABA)和100 μmol·L?1茉莉酸甲酯(MeJA)处理下植株叶片中的表达特征;通过EgrCIN1::GFP载体瞬时转化烟草Nicotiana tabacum进行亚细胞定位;并构建CaMV35S启动子驱动的过表达载体异源转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得3个转基因纯合株系后,对其进行?6 ℃低温、0.5 μmol·L?1ABA等逆境处理,分析EgrCIN1在低温胁迫响应中发挥的功能。  结果  EgrCIN1是巨桉中特有的基因,不含内含子,没有跨膜结构,启动子含有多个与逆境响应相关的顺式作用元件。该基因在茎和叶片中都有表达,而在根中不表达;在叶片中其表达受低温处理强烈诱导;同时,干旱、高盐和ABA等非生物逆境因子也能诱导叶片中EgrCIN1的表达,其编码蛋白被定位在叶绿体中。拟南芥中EgrCIN1过表达转基因株系对低温耐受性提高,对外源ABA敏感程度增强。  结论  EgrCIN1是在叶绿体表达,并可能通过ABA依赖途径参与植物低温胁迫响应,提高植物对低温的抗性。图8表2参27     

毛果杨ZHD家族全基因组水平鉴定及在干旱胁迫下的表达分析

  目的  对毛果杨Populus trichocarpa ZHD (PtrZHD)家族进行生物信息学以及干旱胁迫下表达特性分析,为研究PtrZHD在干旱胁迫中的功能提供参考。  方法  利用生物信息学方法从全基因组水平鉴定出毛果杨ZHD家族全部成员,并对其进化、理化性质、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件和表达特性进行分析。  结果  毛果杨ZHD家族包括21个成员,可分为7个亚家族;有8对同源基因,且非同义替换率(K_a)/同义替换率(K_s)值远小于1。该家族成员理化性质存在差异,但其结构较为保守,均含有Motif 1;启动子区含有数量不等的激素和非生物胁迫响应元件,不同基因之间响应元件的种类存在差异。在毛果杨PtrZHDs中,分别有1、7和13个基因在根、茎和叶组织中具有偏好性表达特征;PtrZHD家族成员对干旱胁迫的响应具有组织和时间表达特异性,在根、茎和叶部组织中各成员的表达量不同,但随着干旱胁迫时间的增加均呈先上升后下降的趋势。  结论  PtrZHD家族基因对干旱胁迫有不同程度的响应,可调控毛果杨对干旱胁迫的应答。图6表2参27     

2022 年 2 期目录

  目的  SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-like）是植物特有的转录因子,参与植物幼年期向成年期的转变、营养生长向生殖生长的转变、花发育、孢子发生、叶片和根发育、逆境响应等多个过程,在植物的生长发育过程中起着非常重要的作用。探究白桦中BpSPL6基因启动子区的顺式作用元件,以及该启动子在正常和胁迫条件下的表达模式,可为进一步研究BpSPL6基因的功能提供参考,也可为了解白桦的抗逆机制提供依据。  方法  以本实验室组培白桦的总DNA为模板,经PCR克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,用PLACE和Plant CARE在线软件分析启动子区的顺式作用元件。构建BpSPL6基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体并转化拟南芥,探究其组织表达特性和胁迫条件下的表达模式。  结果  PCR成功克隆了BpSPL6基因上游1 703 bp的启动子序列,对启动子区的顺式作用元件预测发现除了含有核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还包括2种特异组织表达元件（根、花粉）,10种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸）,4种脱水响应元件等。对转基因拟南芥进行GUS染色结果表明,BpSPL6基因启动子驱动的GUS基因在转基因拟南芥中的表达具有时空特异性。在拟南芥的整个发育过程中,BpSPL6基因启动子驱动GUS基因在真叶叶片中表达,但是表达部位不同。随着叶片的生长,首先在叶片的顶端表达,随后扩展到叶片的叶脉并直至整个叶片,并且表达量逐渐升高。同时BpSPL6基因启动子驱动的 GUS 基因在拟南芥营养生长时期的根部都有表达。并且经氯化钠和甘露醇胁迫后其表达量降低。对比两种胁迫,受到氯化钠胁迫后GUS基因的表达量变化更大,说明对氯化钠胁迫的响应更加强烈。  结论  BpSPL6基因可能参与了植物的叶片、根发育以及对盐和干旱胁迫的响应。      

AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能分析

  目的  茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)可以催化茉莉酸(jasmonic acid,JA)形成茉莉酸的活性形式茉莉酸异亮氨基酸复合体(jasmonic acid-isoleucine,JA-Ile),从而激活JA信号途径。JA信号途径在介导植物盐胁迫的响应中发挥重要作用,因此,探究AtJAR1在植物耐盐性中的功能对于研究JA信号途径影响植物耐盐性的机制具有重要作用。  方法  运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,创建了2个不同的拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体,并对这2个突变体进行地上部生物量的统计分析和JA信号标记基因的表达分析,以确定AtJAR1基因功能缺失。之后,观察分析不同浓度氯化钠和脱落酸(ABA)处理对jar1突变体的种子萌发和幼苗建成的影响,明确AtJAR1基因对拟南芥耐盐性的影响。最后,通过比较分析盐处理前后野生型和突变体的钾离子(K+)和钠离子(Na+)质量摩尔浓度,以及高亲和力K+转运蛋白基因AtHAK5的表达变化情况,初步探究AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能。  结果  JA信号标记基因AtVSP1和AtVSP2的表达量大幅下调,表明AtJAR1基因功能丧失。与点突变产生的jar1-1突变体不同的是,这2个突变体表现为前3周生长加快,之后逐渐减缓并出现叶片萎蔫的表型。同时,AtJAR1突变可以缓解盐胁迫和ABA对种子萌发和根系生长产生的抑制作用。此外,盐胁迫下AtJAR1突变可以促进AtHAK5的表达和根系对K+的吸收转运。  结论  JA信号途径可能通过与ABA交互作用影响AtHAK5的表达量,以调节植物根系对K+的吸收转运,进而改变细胞内K+/Na+平衡,最终影响植物耐盐性。图8表2参52     

白桦BpPAT1基因的表达模式及耐盐性分析

  目的  GRAS家族是植物特有的具有高度保守羧基末端的转录因子家族,已有研究表明GRAS转录因子是植物胁迫反应中关键的转录调节因子之一。本研究拟对白桦中GRAS转录因子基因BpPAT1基因是否具有耐盐能力进行分析,为阐明白桦GRAS转录因子响应盐胁迫的分子调控机制奠定基础,进一步丰富木本植物GRAS转录因子响应逆境胁迫分子机制的研究。  方法  从盐胁迫白桦转录组数据中筛选并获得了1条GRAS转录因子基因,将其命名为BpPAT1。利用蛋白多序列比对及系统进化树来分析BpPAT1与其他GRAS家族蛋白的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析盐胁迫及非胁迫条件下白桦根、茎和叶组织中BpPAT1的表达模式,初步鉴定其是否响应盐胁迫。为了进一步分析BpPAT1的抗逆功能,构建其植物过表达载体（pROKII-BpPAT1）与抑制表达载体（pFGC5941-BpPAT1）,利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系,获得BpPAT1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株。在盐胁迫下分别对BpPAT1瞬时表达及对照植株的耐盐相关生理指标进行测定,鉴定BpPAT1是否能调控白桦的耐盐能力。  结果  多序列比对及系统进化树分析结果表明BpPAT1蛋白具有GRAS家族的序列特征,且与拟南芥中AtPAT1蛋白的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明:在盐胁迫6 h后,BpPAT1在白桦植株中的表达量显著上升（P < 0.05）,说明该基因能响应盐胁迫。抗逆生理指标的测定结果表明:在白桦中过表达BpPAT1能够使过氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性显著增强（P < 0.05）,同时增加了白桦组织中的脯氨酸含量,降低了电解质渗透率及丙二醛含量。  结论  白桦BpPAT1基因能响应盐胁迫,过表达BpPAT1显著增加了白桦POD、SOD酶活性和脯氨酸含量,降低了电解质渗透率及丙二醛含量,进而提高了ROS清除能力,有效增强了白桦的耐盐能力。      

基于全长转录组序列、核基因与叶绿体基因分析琼岛杨在杨属的亲缘关系

  目的  琼岛杨是我国热带地区发现的一种杨树，至今其分类和进化鲜有报道。本研究旨在通过三代全长转录组测序等方法了解琼岛杨在杨属中的分类与进化。  方法  基于Pacbio Sequel测序技术获取的热胁迫下琼岛杨、加杨和小叶杨完整全长转录本数据，通过直系同源基因计算非同义替换值（Ka）、同义替换值（Ks）及Ka/Ks值，比较直系同源基因在热胁迫下的表达模式，并结合毛果杨和簸箕柳的直系同源基因，构建了5个树种的进化树来分析杨树亲缘关系。通过克隆琼岛杨核基因（nrDNA:UDP-SQ和POPTRDRAFT_575699）和叶绿体基因（cpDNA:atpⅠ和trnF），分析基因序列在琼岛杨种群中的多态性，计算琼岛杨种内遗传距离，及与19个树种（5个杨树组和1个类外群组）的种间遗传距离。基于最大似然法和最小进化法构建了琼岛杨与19个树种的进化树，以分析琼岛杨在杨属的亲缘关系。  结果  三代转录组测序共获得660组琼岛杨、小叶杨和加杨的直系同源基因，Ks平均值为0.150 5，峰值为0.02，Ka/Ks < 1，占比97.27%，这显示了3种杨树较近的亲缘关系。直系同源基因表达模式分析发现，3种杨树在热胁迫下具有相同的表达模式。利用遗传距离法计算琼岛杨与19个树种中atpⅠ、trnF、UDP-SQ和POPTRDRAFT_575699等4种基因遗传距离的平均值，发现琼岛杨与白杨组具有最近亲缘关系，平均值为0.011。  结论  基于三代全长转录组测序获得的直系同源基因分析显示出，琼岛杨与其他杨树具有较近亲缘关系。克隆cpDNA和nrDNA基因，计算遗传距离和构建的进化树均表明琼岛杨与白杨组具有最近亲缘关系。cpDNA的多态性以及进化分支置信度明显高于nrDNA，表明在琼岛杨中cpDNA比nrDNA基因更具备物种鉴别能力。      

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子(NAC secondary wall thicking promoting factor)调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNSTCDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素(GA3),水杨酸(SA)和多效唑(PCB)诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成(60.83%);三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高(49%—55.9%),并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平(12h)分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素(13%)、总糖(7%)和木质素(11.7%)含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因(PAL,4CL等)及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

白桦BpMADS3 基因的功能分析

利用RT鄄PCR 技术,揭示了BpMADS3 基因在白桦不同组织中的差异表达模式:BpMADS3 基因仅在花器官中 强烈表达,在茎、叶组织中不表达。采用染色体步移法克隆BpMADS3 基因上游启动子,获得1 426 bp 长度启动子序 列,构建BpMADS3 基因启动子驱动GUS 基因植物表达载体,在拟南芥转基因植株中GUS 染色表明,GUS 活性集中 在萼片和心皮中。在拟南芥ap1 突变体中过量表达BpMADS3 基因,能恢复拟南芥ap1 突变体花器官的正常发育。 BpMADS3 基因转化烟草发现,转基因植株出现早花表型,且转基因烟草植株中相关开花基因表达水平均上调。      

基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

目的COBRA对植物生长发育具有重要作用，已有的研究表明，植物COBRA基因与其次生生长有关。为探究树木COBRA基因信息及部分基因功能，我们对毛果杨PtrCOBRA基因家族展开识别和分析性研究。方法分析PtrCOBRA家族成员关系时运用系统进化树，确定毛果杨PtrCOBRA家族基因的各组织转录表达时采用半定量RT-PCR，创制PtrCOBRA3基因突变体时使用Cas9/gRNA基因编辑策略，毛果杨遗传转化采用农杆菌介导组培幼苗茎段浸染法。结果我们识别毛果杨基因组上存在14个PtrCOBRA基因成员，进化树显示PtrCOBRA家族分成两个分支。半定量RT-PCR表明，PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度、特异地转录表达，在木质化茎节中其转录水平也较高。基于Cas9/gRNA技术我们敲除了毛果杨PtrCOBRA3，获得4株ptrcobra3敲除突变体。ptrcobra3突变体植株表型:植株矮小，叶片细长且卷曲，茎干略有弯曲。结论PtrCOBRA3和PtrCOBRA11是PtrCOBRA家族中与毛果杨次生生长相关的主要成员；基因敲除遗传证据显示PtrCOBRA3基因参与毛果杨茎干次生生长，PtrCOBRA11与它存在功能的冗余。