贵州白山羊GDF9基因编码区1007位点的多态性

生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因是卵母细胞分泌的生长因子,调节卵泡的早期生长和分化。对贵州白山羊GDF 9基因的研究结果显示,编码区1007位碱基与已知山羊不同。为了研究1007位点对贵州白山羊繁殖力的影响,采用锚定PCR对GDF 9基因外显子2第18位氨基酸密码子所在区域进行了扩增、克隆测序和基因型分析,结果表明,GDF 9基因编码区1007位点表现出C/T多态性,使成熟肽第18位氨基酸为丙氨酸/缬氨酸替换;低产母羊均为杂合基因型,高产母羊中90%为杂合基因型,高产羊群与低产羊群之间基因型频率差异不显著（P＞0.05）,表明GDF 9基因1007位点的多态性与贵州白山羊产羔数之间没有直接的相关性。     

贵州白山羊GDF 9和BMP15基因多态性与产羔数的相关性研究

生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白l5(BMP15)是早期卵泡生长和分化的必需因子。从贵州白山羊GDF9基因外显子2中找出1个、BMP15基因外显子2中找到3个位点发生碱基替换。为了进一步研究这4个位点在群体中是否存在多态性,采用等位基因特异性PCR方法对贵州白山羊的高产羊群和低产羊群2个基因的4个位点进行对比。结果表明:从贵州白山羊的高产羊群和低产羊群GDF9基因外显子2的790位点都检测到AA、AB 2种基因型,AB基因型对应的产羔数较多(P<0.05),790位点的变异与已知序列不同。BMP15基因外显子2的675位点只检测到1种基因型,没有多态性;BMP15基因外显子2的573位点和798位点均检测到多态性,其中798位点的碱基变异与已知基因序列不同;从贵州白山羊高产羊群中这2个基因位点都检测到了野生型、杂合型和突变型3种基因型,对应的产羔数为野生型最少,突变型最多,杂合型居中。推测GDF9基因790位点多态性对山羊繁殖率的调节方式可能与绵羊相似,但BMP15基因573和798位点的突变对贵州白山羊产羔数的促进作用,可能以数量遗传效应为主,值得深入研究。     

贵州白山羊GDF9基因外显子2的多态性研究

生长分化因子9(GDF9)是卵母细胞分泌的生长因子,对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用RFLP和SSCP方法检测贵州白山羊GDF9基因外显子2的单核苷酸多态性,结果表明:在所有检测样本中均未发现GDF9基因的FecGH突变;在高繁殖率(3羔以上/胎)母羊和公羊中检测到8个杂合的AB基因型,其中5个为高产的母羊,3个为公羊。碱基序列分析证实GDF9基因编码区第1189bp位点的碱基由G突变为A,该位点位于外显子2中,导致活性肽第79位缬氨酸突变为异亮氨酸(V79I),但在低繁殖率(1~2羔/胎)母羊中没有发现该突变。虽然贵州白山羊GDF9基因中G1189A突变的发生率仅为5%,但该位点编码的氨基酸与FecGH突变(S77F)仅相隔1个氨基酸,因此推测GDF9基因中的G1189A突变可能与贵州白山羊的高繁殖力有关。     

黔北麻羊GDF9基因多态性与产羔性能关系的研究

为了研究黔北麻羊GDF9基因多态性与产羔性能的关系,试验采用直接测序的方法对黔北麻羊的生长分化因子9(GDF9)基因外显子2核苷酸多态性及其与产羔数的关系进行了分析。结果表明:在黔北麻羊群体GDF9基因外显子2的959 bp处存在A→C的碱基突变,导致所编码的氨基酸由谷氨酰氨(Gln)突变为脯氨酸(Pro)。通过最小二乘法分析SNPs及其与产羔数的关联,结果表明:该突变对黔北麻羊平均产羔数有极显著影响(P0.01),平均产羔数在所检测到的2种基因型中呈现出ACAA,AC基因型比AA基因型平均产羔数多0.85只,突变杂合子个体产羔数极显著增加(P0.01)。     

贵州白山羊BMP15基因多态性研究

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因是控制Belclare和Cambridge等绵羊的高繁殖力主效基因,BMP15蛋白中单个氨基酸的改变直接影响绵羊的产卵率和产羔数。采用RFLP和SSCP技术检测BMP15基因中绵羊高繁殖力突变类型FecXG和FecXB在贵州白山羊中的分布。结果表明,在贵州白山羊样品中没有检测到BMP15基因的FecXG突变,说明该突变在贵州白山羊中的自然发生率非常低;在贵州白山羊高产母羊和公羊中检测到BMP15的FecXB突变,以杂合的AB基因型存在,低产母羊中没有检测到该突变,提示BMP15基因的FecXB突变可能是影响贵州白山羊繁殖力的因素之一。     

贵州白山羊PRDM16基因表达及多态性与生长性状关联分析

为了分析贵州白山羊PRDM16(Positive Regulatory Domain Containing 16,PRDM16)基因表达水平及核苷酸变异位点（SNPs）与生长性状的关联性，本研究利用混合池测序筛选PRDM16基因变异位点，采用PopGene 32.0软件计算等位基因频率、基因型频率、遗传纯合度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和Hardy-Weinberg平衡状态；应用PIC软件计算多态性信息含量（PIC），应用RT-PCR检测PRDM16基因在不同性别白山羊背最长肌中表达水平；应用MINTAB软件分析核苷酸变异与生长性状的关联性。结果表明，贵州白山羊PRDM16基因P2区存在1个核苷酸变异位点g.342 A/G，且该位点的Ho高于He,PIC检测为中度多态，偏离Hardy-Weinberg平衡状态。RT-PCR结果表明，PRDM16基因mRNA在母羊背最长肌中的表达水平显著高于公羊。关联分析表明，贵州白山羊PRDM16基因g.342 A/G位点变异与胸围显著相关，存在等位基因A的群体具有更高的胸围指标，且等位基因间存在协同效应，杂合型群体AG较纯合型...     

晋岚绒山羊多胎性能4个候选基因的研究

为探寻辅助育种的分子标记,提高绒山羊产羔数,本实验在山西省某绒山羊养殖场分别选取20只经产双羔母羊和单羔母羊,检测多胎性能候选基因GDF9、BMP15、FSHβ和GnRHR所有编码区SNPs位点;选取有差异的基因位点在171只经产母羊(90只双羔母羊和81只单羔母羊)中进行SNPs位点检测,统计基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)和期望杂合度(He),并与母羊产羔数进行关联分析。结果显示:共发现17个SNPs位点,仅GDF9基因A959C位点和BMP15基因G735A位点在单、双羔母羊间有差异。SNaPshot检测表明GDF9基因A959C位点有AA、AC、CC 3种基因型,A为优势等位基因,AA为优势基因型,含CC、AC基因型个体的产羔数显著高于AA型。BMP15基因G735A位点共检测到GG、AG、AA 3种基因型,G为优势等位基因,GG为优势基因型;含AA、AG基因型个体的产羔数显著高于GG型。本研究结果表明GDF9基因A959C位点C等位基因和BMP15基因G735A位点A等位基因与晋岚绒山羊高产羔数呈极显著正相关,可作为分子标记对晋岚绒山羊进行辅助育种。     

海南黑山羊GDF9和BMP15基因多态性与初胎产羔数间的关系

为了探究海南黑山羊生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)基因多态性与初胎产羔数间的关系,采用PCR扩增海南黑山羊GDF9和BMP15基因序列,通过基因测序检测2个基因中SNP位点的多态性分布情况,并与初胎产羔数进行关联分析。结果:在海南黑山羊GDF9基因中共发现3处碱基突变,分别位于GDF9基因的第1外显子、第2外显子和3′端,在BMP15基因中共发现2处碱基突变,分别位于BMP15基因的5′端和第2外显子;在GDF9基因+183处的A/C突变位点、+2 082处的A/C突变位点、+2 541处的C/T突变位点上,海南黑山羊的优势基因型分别是CC、AA和CT,在BMP15基因-519处的A/G突变位点、+6 124处的C/G突变上,海南黑山羊的优势基因型分别是AG和CC;GDF9基因+2 541处的C/T突变与初胎产羔数呈显著相关,TT基因型个体的产羔数显著高于CC基因型个体(P0.05)。本试验为通过基因标记辅助选择提高海南黑山羊的产羔数奠定基础。     

GDF9基因多态性对山羊血清FSH和LH水平的影响

为了研究GDF9基因多态性与多胎山羊血清促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体素(lutein hormone,LH)水平的关联,试验选择经GDF9基因型鉴定后的自然发情健康经产安徽白山羊母羊80只,采集血样,应用PCR-SSCP检测GDF9基因的多态性,用全自动化学发光免疫分析法(CLIA)测定FSH和LH水平。结果表明:安徽白山羊群体中GDF9基因外显子存在2个SNPs,均出现3种基因型,在EF4461682:c.1956AC位点,不同基因型母羊外周血中FSH水平无明显差异,但CC型外周血中LH水平高于AA型(P005)。CC型和AC型产羔数(LSM)没有差异,但都显著高于AA型(P005);在EF4461682:c.3319GA位点,AA型外周血中FSH水平显著高于GG型(P005);AA型外周血中LH水平极显著高于GA和GG型(P001),GA型外周血中LH水平显著高于GG型(P005)。AA型平均产羔数LSM极显著高于AG型和GG型(P001),AG型平均产羔数LSM极显著高于GG型(P001)。由此得知,GDF9基因作为影响安徽白山羊产羔数的主效基因之一,其功能表达对FSH和LH水平起着重要影响。     

母羊多胎性候选基因GDF9的研究进展

生长分化因子9(GDF9)是转化生长因子β超家族的一个新成员。近年来研究发现,GDF9基因的多态性与哺乳动物的繁殖性状相关。综述了GDF9基因的结构和多态性、生理效应及GDF9基因多态性与母羊产羔性能的相关性研究进展,并对母羊繁殖性能相关功能基因的研究进行了展望,以期为相关领域的研究提供参考。     

山羊生长分化因子9基因FecTT突变检测

本研究采用PCR-RFLP方法检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)基因FecTT突变在济宁青山羊、贵州白山羊、大足黑山羊、陕南白山羊、古蔺马羊、马头山羊、波尔山羊、成都麻羊、萨能奶山羊、文登奶山羊、板角山羊、金堂黑山羊、关中奶山羊、川东白山羊、安哥拉山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊等17个山羊品种中的分布。结果表明,在17个山羊品种中都未检测到FecTT突变,提示,GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上17个山羊品种的繁殖力均没有显著影响。     

番鸭GDF9基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对番鸭（Cairina moschata）生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因进行克隆及结构和功能的预测,并检测其在就巢期和产蛋期番鸭各组织中的表达差异。【方法】 以番鸭卵巢组织cDNA为模板,利用快速扩增cDNA末端（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术对GDF9基因进行扩增和克隆,利用生物信息学软件对GDF9基因的编码序列进行相似性分析和进化树构建,分析其基本理化性质和编码氨基酸序列的结构特征。利用实时荧光定量PCR技术检测就巢期番鸭和产蛋期番鸭各组织中GDF9基因的相对表达量。【结果】 GDF9基因CDS区全长1 380 bp,编码459个氨基酸;番鸭GDF9基因序列与GenBank已公布的凤头潜鸭、绿头鸭、天鹅、棕硬尾鸭、浙东白鹅、企鹅、鸡、牛、绵羊、猪和小鼠对应序列的相似性依次为98.8%、97.5%、96.4%、95.8%、94.4%、90.2%、87.5%、64.5%、64.2%、63.9%和60.6%。系统进化树结果显示,番鸭与凤头潜鸭和绿头鸭的亲缘关系较近,与小鼠的亲缘关系较远。GDF9蛋白分子质量为52.81 ku,是一种不稳定的碱性亲水膜外蛋白,有1个信号肽,含有45个磷酸化位点,8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,存在1个转化生长因子-β（TGF-β）结构域;蛋白质的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、T-转角和β-折叠构成,所占比例分别为58.61%、22.22%、16.56%和2.61%。GDF9蛋白三级结构预测结果与二级结构一致。GDF9蛋白可能与BMP15、BMPR1B、BMPR2、TGFBR1、ACVR1B、POF1B、ZP2、ZAR1和MOS蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,就巢期和产蛋期番鸭各组织中均有GDF9基因的表达,其中两个时期卵巢中的表达量均最高,且均极显著高于同一时期其他组织基因表达量（P<0.01）。同一组织不同时期相比,就巢期番鸭GDF9基因在脾脏、心脏和肾脏的表达量显著或极显著低于产蛋期（P<0.05;P<0.01）,在卵巢中的表达量极显著高于产蛋期（P<0.01）,其他组织中的表达量在两个时期间差异均不显著（P>0.05）。【结论】 本研究成功克隆番鸭GDF9基因,GDF9基因在番鸭各组织中均有表达,GDF9基因为番鸭产蛋期和就巢期卵巢、心脏、肾脏和脾脏的差异表达基因。该研究为进一步探索番鸭GDF9基因的功能提供了理论依据,也为研究GDF9基因在卵巢发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

Construction of GDF9 Lentiviral Vector and Its Stable Expression in Goat Primary Fibroblasts

This study was aimed to constract growth differentiation factor 9 (GDF9) lentiviral vector,which was stably expressed in goat primary fibroblast. The CDS of sheep GDF9 gene was cloned by gene synthesis, the CDS was 1 362 bp, encoding 453 amino acids. After double enzyme digestion and ligation, the GDF9 fragment was sub-cloned into an empty lentiviral vector. The GDF9 lentiviral vector and the packaging plasmids were co-transfected into 293T cells, and the lentivirus with titer of 1×10⁶ TU/mL was obtained. The goat primary fibroblasts were transfected with GDF9 lentivirus, the red fluorescence could be observed in more than 60% of the cells, suggesting the prepared lentivirus had high infection efficiency to goat primary fibroblasts. After puromycin screening, all cells were able to observe red fluorescence. Real-time quantitative PCR analysis showed that the GDF9 expression level was higher than that of control group. The results indicated that the goat primary fibroblasts stably expressing GDF9 were successfully obtained. This results might lay a foundation for the function study of GDF9 and the goat germplasm resources innovation in the future.     

GDF9慢病毒载体的构建及其在山羊原代成纤维细胞中的稳定表达

试验旨在构建山羊生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）慢病毒载体,并使其在山羊原代成纤维细胞中稳定表达。利用全基因合成法克隆了绵羊GDF9基因的CDS全长片段,长约1 362 bp,编码453个氨基酸。利用双酶切和连接,将GDF9基因片段亚克隆至慢病毒载体中,构建了过表达GDF9的慢病毒载体。将慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293T细胞后,获得了滴度为1×10⁶ TU/mL的慢病毒。利用制备的GDF9慢病毒感染山羊原代成纤维细胞后,观察荧光表明,60%以上的细胞能够观察到红色荧光,说明制备的慢病毒对山羊原代成纤维细胞具有较高的感染效率。经过嘌呤霉素筛选后,所有的细胞均能观察到红色荧光。实时荧光定量PCR分析表明,制备的细胞系中GDF9表达水平比对照组高12.17倍,说明成功获得了稳定表达GDF9的山羊成纤维细胞系。本试验结果为进一步研究GDF9基因的生物学功能,以及山羊未来的种质资源创新奠定基础。     

Effect of GDF9 on Sheep Cumulus Cell Proliferation

The purpose of this study was to investigate the effect of growth differentiation factor 9 (GDF9) on the gene expression of cumulus cells expansion and hormone receptors as well as hormone secretion,in order to provide evidence for the role of GDF9 in the development of sheep cumulus cells.Sheep cumulus cells were used as the research object in this study,and were cultured for 48 h by adding different concentrations (0,50,100,200,400 ng/mL) GDF9 to low serum cell culture medium.Total RNA were extracted from the cells,using β-actin as the reference gene,Real-time quantitative PCR technology were used to detect the cumulus cells expansion related genes hyaluronic acid synthase gene 2 (HAS2),prostaglandin lead oxide synthase 2 (PTGS2),pentraxin 3 (PTX3) and hormone receptor genes follicle-stimulating hormone receptor (FSHR),luteinizing hormone receptor (LHR) and estrogen receptors (E₂R).Using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method to test the content of E₂ and P₄.The results showed that HAS2,PTX3,FSHR,E₂R and LHR mRNA relative expression of 200 ng/mL GDF9 group was extremely significantly higher than the control group and other GDF9 groups (P<0.01),PTGS2 mRNA relative expression was extremely significantly higher than the control group and 50,400 ng/mL GDF9 groups (P<0.01),and significantly higher than 100 ng/mL GDF9 group (P<0.05).When added 400 ng/mL GDF9,the relative mRNA expression of all the mentioned-above genes were all extremely significantly lower than that of the 200 ng/mL GDF9 group.Moreover,the E₂ secretion level was extremely significantly higher than that of the control group and 50 ng/mL GDF9 group (P<0.01),significantly higher than that of the 100 ng/mL GDF9 group(P<0.05),while had no significant difference from the 200 ng/mL GDF9 group (P>0.05).When added 100,200 and 400 ng/mL GDF9,the concentration of P₄ was significantly higher than the control group (P<0.05),and there was no significant difference from the 50 ng/mL group (P>0.05),and there was no significant difference between 100,200 and 400 ng/mL GDF9 groups (P>0.05).To sum up,GDF9 could promote the expansion of sheep cumulus cells and participated in the regulation of hormone secretion of sheep cumulus cells.     

母羊多胎性候选基因GDF9的研究进展

生长分化因子9（GDF9）是转化生长因子β超家族的一个新成员。近年来研究发现,GDF9基因的多态性与哺乳动物的繁殖性状相关。综述了GDF9基因的结构和多态性、生理效应及GDF9基因多态性与母羊产羔性能的相关性研究进展,并对母羊繁殖性能相关功能基因的研究进行了展望,以期为相关领域的研究提供参考。     

GDF9对绵羊卵丘细胞增殖的影响

本试验旨在探究生长分化因子9（GDF9）对卵丘细胞扩展相关基因和激素受体基因表达量及激素分泌的影响,为GDF9在绵羊卵泡发育中的作用提供依据。以绵羊卵丘细胞为研究对象,通过在低血清细胞培养液中添加不同浓度（0、50、100、200、400 ng/mL）的GDF9,培养绵羊卵丘细胞48 h后,提取细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术,以β-actin为内参基因,检测卵丘细胞扩展相关基因透明质酸合酶2（HAS2）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、穿透素3（PTX3）及激素受体相关基因卵泡刺激素受体（FSHR）、促黄体生成素受体（LHR）和雌激素受体（E₂R）的mRNA相对表达量;利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇（E₂）和孕酮（P₄）含量。结果显示：在细胞培养液中添加200 ng/mL GDF9时,HAS2、PTX3、FSHR、E₂R和LHR的mRNA相对表达量极显著高于对照组与其他处理组（P<0.01）;PTGS2 mRNA相对表达量极显著高于对照组、50和400 ng/mL GDF9组（P<0.01）,显著高于100 ng/mL GDF9组（P<0.05）。当添加400 ng/mL GDF9时,各基因mRNA相对表达量均极显著低于200 ng/mL GDF9组（P<0.01）;E₂分泌量极显著高于对照组与50 ng/mL GDF9组（P<0.01）,显著高于100 ng/mL GDF9组,与200 ng/mL GDF9组差异不显著（P>0.05）。100、200和400 ng/mL GDF9组P₄分泌量显著高于对照组（P<0.05）,与50 ng/mL GDF9组没有显著差异（P>0.05）,且3组之间差异不显著（P>0.05）。综上所述,GDF9能够促进绵羊卵丘细胞扩展,并参与绵羊卵丘细胞激素分泌的调控。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系.本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应(PCR)方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码...