丙型肝炎病毒融合抗原基因NS3CE对番茄的遗传转化

丙型肝炎病毒是危害人类健康重要的病源之一,研制安全、经济、有效和易于推广使用的抗病毒疫苗是预防和控制HCV的有效手段.本实验用PCR 方法克隆了HCV中能够产生中和性抗体、具有很好免疫原性的非结构NS3区基因片段及核心抗原CE基因片段,并在两段基因之间加入连接肽SPGS的密码子序列,构建成融合抗原基因 NS3-CE.将该融合基因     

猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定

通过原核表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒( TGEV) S基因不同编码区,以鉴定不同编码区表达产物与TGEV抗体的结合能力。在对TGEV S蛋白抗原位点分析的基础上,针对S蛋白N端的4个抗原位点C、B、D和A,设计引物分别扩增含C、B位点的TCB片段(411 bp)、含D位点的TD片段(441 bp)和含A位点的TA片段(456 bp),经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,SDS-PAGE电泳显示各片段均高效表达,表达的TCB片段、TD片段和TA片段融合蛋白大小分别为34.6,35.1,36.1 kDa。 Western Blot结果表明,表达蛋白与TGEV感染猪阳性血清和His标签抗体均产生阳性反应。结果显示,3个S基因编码片段均具有与TGEV抗体结合的能力,为进一步鉴定不同编码区的免疫原性及抗原保护能力奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

犬瘟热病毒Lederle株H,N全基因序列分析及表达研究

采用RT-PCR方法自犬瘟热病毒Lederle株基因组RNA中扩增出H基因(1 911 bp)和N基因(1 707 bp)片段,序列测定和分析表明与Onderstepoort株、CDV3株等疫苗毒株的同源性在95%以上,而与野外分离株的同源性介于90%～95%;以获得的H,N全基因片段为模板,分别扩增H基因近3′端996 bp的基因片段以及N基因中间高度保守区562 bp的基因片段,经克隆测序后分别插入原核表达载体pET-32a中进行表达,结果显示H片段和N片段分别表达大小约为57 kD和37 kD的融合蛋白,Western blotting检测结果显示,表达蛋白均可与CDV抗血清发生阳性反应,提示原核表达产物具有与CDV抗血清结合的免疫反应性。     

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及纯化

根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。     

水稻草状矮化病毒基因组RNA1-3的分子生物学

水稻草状矮化病毒(以下简称水稻草矮病毒,Rice grassy stunt virus,RGSV),是纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组RNA组成。该病于20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国的福建、台湾、广东、广西和海南等地也有分布。与同属病毒其它成员相比,RGSV分子生物学研究进展较为缓慢,直至1998年才报道病毒基因组全序列,其基因组包含6个ssRNA片段,其中RNA1,2,5和6分别对应于纤细病毒属其它病毒的RNA1-4。6个片段均采用双义编码策略。这不仅在纤细病毒属中,在植物病毒中也是独特的。有鉴于此,本文对水稻草矮病毒沙县分离物(RGSV-SX)RNA1-3的分子生物学及部分基因功能进行了研究(RGSV-SX RNA1-3全长序列已递交GenBank登录,登录号分别为：AF509470、AF511072、AF397468)。根据RGSV菲律宾北方分离物(RGSV-IR)序列设计合成引物,通过RT-PCR获得了覆盖RGSV-SX基因组RNA1-3的cDNA克隆。序列分析结果表明,RGSV-SX分离物RNA1长9764个核苷酸,与已发表的RGSV菲律宾IR、SC分离物相比,核苷酸序列同源性均为99．6％,其中,NS1蛋白三个分离物间的氨基酸序列同源性为100．0％、RdRP氨基酸序列同源性分别为95．0％、95．0％、99．0%;RNA2全长4071个核苷酸,RNA2与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为97．6％、99．3％,NS2氨基酸序列同源性分别为99．5％、99．0%,NSvc2氨基酸序列同源性分别为96．3％、96．9％;RNA3的全长为3120个核苷酸,整个片段与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为98．7％、91．0%,NS3氨基酸序列同源性分别为98．4％、96．4%;NSvc3氨基酸序列同源性分别为99．2％、81．9％。对RGSV各分离物(SX、IR、SC)间RNA1-6核苷酸序列同源性进行多重比较结果表明,RGSV存在明显的重排现象,不同分离物的相应RNA片段存在积累突变的差异。以RNA2、RNA3变异程度较大,SX的RNA2与IR变异较大,变异率达2．36％,更接近于SC分离物,而SX的RNA3-6则与IR分离物更接近,SX的RNA1与IR、SC有变异,但变异不大,且三个分离物间的变异主要发生在基因间隔区。这些结果表明,SX与IR同源性更高,二者具有较近的亲缘关系,而与SC的差异较大,这在分子水平上也进一步确定了SX与IR分离物相近,而与SC分离物相差较远,由此可以推测,我国沙县分离物SX可能来源于菲律宾北方分离物(IR),并在流行过程中经介体昆虫传播发生了较少的基因内重排或变异。对RGSV-SX的vRNA3 ORF片段进行克隆、原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达,并制备了抗血清,为进一步开展NS3基因及它所编码蛋白的功能研究打下基础。通过建立水稻原生质体培养体系,经聚鸟氨酸(PLO)介导将提纯的水稻草矮病毒(RGSV)接种到水稻原生质体内,按不同时间取样,提取其总蛋白,以RGSV抗血清、制备的NS3融合蛋白抗血清及提纯的病害特异性蛋白SP(NS6)抗血清为探针,采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(Western-blot),研究RGSV在水稻原生质体内的表达周期。构建了含NS3基因的植物表达载体pCBTNSv3,转化农杆菌,用以转化水稻的研究。在实验过程中详细比较了根癌农杆菌转化水稻的各种条件,建立了农杆菌介导的水稻转化的优化系统,克服了再生植株难的问题,获得了转RGSV NS3的水稻转基因再生植株,经鉴定,初步证实NS3基因已整合到水稻的基因组中。     

昆虫细胞中表达eGFP基因的重组杆状病毒的构建

为构建表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体。利用Sf-9细胞表达eGFP,用PCR法从重组Bacmid和pEGFP-C3质粒中扩增gp64SP、eGFP和VSVGED片段,利用一步法SOE-PCR将3个片段连接在一起。用Xba I和Hind III酶切融合片段与pFastBac PH,连接获得阳性质粒命名为pFB/LM-PH。转化E.coli DH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Bv-LM-PH,感染Sf9昆虫细胞。结果表明：通过倒置荧光显微镜观察细胞形态及荧光表达情况,结果证实：感染的Sf9细胞可表达外源基因eGFP。重组pFB/LM-PH载体具备表达eGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达eGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。     

应用乙肝核心抗原增强肌肉抑制素免疫原性的研究

为提高肌肉抑制素(Myostatin,MSTN)免疫原性,进行了乙肝核心抗原(HBcAg)作为分子佐剂可能性的研究.利用PCR方法获得了MSTN的C端片段,并分别在乙肝核心抗原的N端、C端及中间位点融合,构建了3个融合表达克隆:pET-30a-MSTN/HBcAg(N)、pET-30a-MSTN/HBcAg(C)和pET-30a-MSTN/HBcAg(M),转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,然后利用Ni~(2+)亲和层析纯化融合蛋白.应用重组蛋白免疫小鼠后利用间接ELISA法检测抗血清效价.结果表明:融合蛋白免疫效果要显著优于MSTN(P＜0.05);融合蛋白MSTN/HBcAg(M)的免疫效果最佳.乙肝核心抗原可以作为分子佐剂以增强肌肉抑制素免疫原性.     

鸡新城疫病毒La Sota株F基因克隆及原核表达

参照NDVLa Sota株核酸序列(AF077761)设计1对引物,利用RT-PCR扩增F基因并得到了长为1 700 bp的片段,将其克隆到pGEM-T easy vector中,经酶切鉴定和测序后克隆进原核表达载体pET-32a,将重组表达质粒转化BL21(DE3),在IPTG诱导下表达约83 kd的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blotting检测证实该基因片段获得高效表达且表达产物具有免疫学活性。     

构建结球甘蓝KIN基因在叶绿体基因组定点表达的载体

获得叶绿体基因组定点整合表达载体是开展结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化研究的第一步。本研究克隆了CMS结球甘蓝的抗冻蛋白KIN基因,发现该基因定位于结球甘蓝的2号染色体上。通过构建中间载体p KA和p AI,将KIN基因的编码区构建到了CMS结球甘蓝叶绿体基因组定点整合表达载体p IKAA中。该载体以Trn A和Trn I基因片段作为同源整合片段,能整合到CMS结球甘蓝叶绿体基因组中。此外,该载体是双顺反子形式的,即在转录的单条m RNA上,同时包含了KIN和aad A基因编码区。将p IKAA转化到大肠杆菌中,结果显示转化有该载体的大肠杆菌能够在含有氨苄青霉素(AMP)和壮观霉素(SPEC)的固体LB平板中生长。研究结果可为后期CMS结球甘蓝叶绿体基因组的遗传转化体系的建立奠定基础。     

3个烤烟品种（系）在安顺烟区适应性的研究

为了优选适应安顺特色优质烟叶开发的品种,以‘2010-6’、‘A18’、‘贵烟2号’3个烤烟品种（系）为参试品种,以‘K326’为对照在安顺西秀区进行生产试验,分别从生长状况、农艺性状、抗病性、产量及烟叶评吸质量等方面对各参试品种（系）及对照进行分析比较,鉴定参试品种（系）对当地土壤、栽培、烘烤条件的反应和再生产价值。试验结果表明：各参试品种（系）在安顺市西秀区的综合表现来看,均好于对照品种‘K326’,其中以‘贵烟2号’表现最好,‘2010-6’、‘A18’略优于对照品种‘K326’。3个参试品种（系）可作为安顺市特色优质补充品种进一步试验研究。     

基于不同烟草类型基因组重测序的烟草SSR标记的开发和应用

基于基因组重测序的分子标记研究是一种新的方法。本研究在普通烟草基因组序列已完全测定的基础上重测序了4个烟草品种（系）,包括烤烟类型（LY1306,秦烟96）2个,晒烟类型（Wanmao 3）1个,马里兰烟草类型（Wufeng 1）1个。结合在NCBI中测序并发布的K326和TN90品种的基因组序列,分析了这4个重测序的烟草品种的InDel突变和SNP突变位点,鉴定出7个具有品种多态性的SSR候选位点,其中5个SSR位点可扩增出DNA片段。通过对包括不同烟草类型在内的10个烟草品种进行PCR检测,表明本研究选出的SSR位点可用于烟草品种或烟草类型的分类,其中NW-015889872.1、NW-015854676.1和NW-015890969.1等3个SSR位点可有效区分烤烟、白肋烟和马里兰烟以及晒烟烟草类型。     

从品种角度试论提高中国烤烟质量的途径

烤烟质量与卷烟产品质量和烟农植烟效益密切相关,而品种是烤烟生产的基础,从品种角度探讨提高中国烤烟质量的途径和方法具有重要意义。笔者在国内学者研究文献的基础上,归纳了烤烟质量的评价标准及其影响因素,并结合中国烟叶生产实际和育种实践经验,分析了品种对烤烟质量的作用。认为对烤烟质量的评价要结合卷烟工业用户对烟叶质量的具体诉求,就某一特定的生态环境而言,品种是影响烤烟质量诸多因素中的最重要的因素,其对烟叶质量的影响包括遗传背景对烟叶质量的决定作用、与生态条件互作对烟叶质量的强化作用、抗逆抗病性对烟叶质量的保障作用、与生产技术协调对烟叶质量的提升作用诸方面。据此,提出了从品种角度提高中国烤烟质量的途径,包括：（1）面向烟叶生产实际,开展良种选育;（2）强化品种区域布局,实施适地适种;（3）针对品种特征特性,实现良种良法。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

不同灌溉方式对初烤烟叶中性香气物质含量的影响

采用大田试验研究浇灌、沟灌和喷灌3种灌溉方式对烤后烟叶中性致香物质含量的影响,探讨提高烟叶香气物质含量的水分管理技术。结果表明：喷灌灌溉方式极显著提高中上部位烟叶中性致香物质含量,与浇灌和沟灌相比,喷灌处理上桔二(B2F)等级烟叶中性致香物质含量分别提高了8.1%和42.9%,中桔三(C3F)等级烟叶分别提高了26.3%和27.9%,差异均极显著。表明间歇性喷灌补水是一种较优的烤烟灌溉方式,在烤烟成熟期,对改善中上部位烟叶香气量效果显著。     

新型植物生长调节剂对烟草花叶病的控制作用

【研究目的】为开发和创制新的烟草病毒病控制药剂提供依据，从而指导烤烟生产中花叶病的防治问题；【方法】试验设芸苔素内酯400倍，8 %宁南霉素水剂800倍与清水对照(cK)3个处理，3次重复，随机区组设计；【结果】在重庆市黔江烟区，用植物生长调节剂——芸苔素内酯和宁南霉素两种生物药剂进行了防治烟草花叶病毒病侵染烟草的田间试验，结果表明：两种药剂对烟草花叶病均具有比较好的控制效果，相对防效均在70%左右，且对烟草生长具有一定的促进作用。【结论】芸苔素内酯不但能发挥其生长调节剂的功能——促进烟草生长，而且也是防治烟草花叶病的较为理想的药剂。     

四川部分晾晒烟种质遗传关系的SRAP分析

对25份四川地方性晾晒烟材料、1份黄花烟和1份普通烤烟材料进行了SRAP分析。共检测到3 368条扩增带, 其中特异性条带为998条, 平均多态检出率为29.6%。27个应试材料间遗传相似系数在0.26~0.97间, 平均为0.62, 表现出明显的遗传差异;其中黄花烟、烤烟和晾晒烟3个栽培类型间遗传相似系数为0.38~0.78;在25份晾晒烟品种间遗传相似性较高为0.75~0.97, 显示出种内的遗传基础相对比较狭窄, 但苍龙毛烟与其他供试材料有较大的遗传差异。经聚类分析, 可将黄花烟、烤烟和晾晒烟品种划分为3个栽培类别, 反映出栽培类型间的遗传差异;进一步将25份晾晒烟材料分为3个亚类和2个单一品种的个类;但按传统方法命名的多个毛烟品种和柳烟品种未被明显地分别聚为两类。SRAP标记技术能高效揭示亲缘关系很近的晾晒烟种质资源的遗传背景和亲缘关系。     

利用SSR荧光标记技术分析烟草种质的遗传多样性

针对中国烟草栽培品种遗传基础狭窄的情况,分析烟草种资资源的遗传多样性将可为烟草新品种选育、引种和资源保护提供重要信息。据此,利用20个SSR引物组合,采用荧光SSR标记法对来自不同国家和地区的50个烟草种质材料的遗传多样性进行分析。研究结果显示,20对SSR引物在50份烟草种质中检测到81个等位变异,平均每个SSR为4.1,平均多态性位点比率为68.4%;其中引物PT20457的鉴别能力最高,它的扩增多态位点数为6个,多态位点比率为100%,PIC值为0.944。研究的UPGMA聚类分析结果在遗传相似系数约为0.65处将50份烟草种质明显分成了3个组群,组群Ⅰ中只有1个广东晒烟,组群Ⅱ包括2个白肋烟,组群Ⅲ包括来自4个国家的47个品种。主坐标分析将所有种质分成了4个组群8个亚类。2种分析方法均较好地揭示了烟草属种间或栽培种品种类型间的遗传多样性与亲缘关系,可为烟草遗传育种和遗传连锁图谱构建的杂交亲本选择提供科学依据。     

生物降解地膜对烟区土壤温湿度及烤烟产质量的影响

为了减轻烤烟地膜覆盖造成的“白色污染”和揭膜用工问题,通过大田对比试验,进一步探索和验证生物降解地膜和PE地膜对植烟土壤温湿度及烤烟产质量的影响效果。结果表明：在烟田垄体保温、增温效果上,生物降解地膜覆盖具有PE地膜同等的作用效果,能有效促进烤烟生长和烟叶品质的改善,尤其是烤烟大田生长中后期,生物降解地膜能够起到保湿作用,有利于烤烟上部烟叶充分成熟,生物降解地膜覆盖的各处理烤后烟叶外观质量和经济性状均优于对照;生物降解地膜每公顷比对照节约用工60个,纯收入增加5732.25~7431.75元/hm²。综合3种生物降解地膜类型来看,T3（90天开始降解的生物降解地膜）处理在烤烟产量、产值、均价、纯收入等方面是最高的,且烤后烟叶外观质量优于对照,是适合永州烟区的生物降解地膜类型。     

氮钾营养与氮钾平衡对几种烤烟病害的影响

云南是中国的主要烤烟生产区,目前由于单一品种大面积种植及施肥不合理等原因,烤烟病害比较严重,制约着烤烟的品质和经济收入。通过对云南中部地区烤烟中部叶片旺长中期（移栽后60~65d）氮、钾营养及氮、钾平衡研究及田间烤烟病害调查。结果表明;（1）烟叶氮含量普遍较高,而钾素偏低,导致氮/钾比偏高;（2）氮含量高时（N%>4%）,钾素过高（K%>4%）和过低（K%<2%）都增加了烤烟对炭疽病和赤星病的感染率;（3）在氮素含量正常,钾素含量也正常时,氮/钾比协调,抗病能力最强;（4）烤烟烟叶氮/钾>2%,烤烟对病害的抵抗能力下降,且随氮/钾比偏离最适水平,烤烟发病逐渐加重。