甘蓝型油菜GPAT6基因在酵母和拟南芥中的表达分析

利用同源克隆法获得‘湘油15’中长度为1 506 bp的GPAT6基因,并通过酿酒酵母质粒YES2.0和特异性启动子Napin构建了酵母表达载体和植物种子特异表达载体,分别转化酵母和拟南芥。气相色谱分析表明：转BnGPAT6基因的酵母中C14:0脂肪酸比对照高一倍,而C16:0,C16:1,C18:0和C18:1所占比例均明显下降。转基因拟南芥4个株系中种子的总含油量均下降,其中C16:0、C18:2和C18:3的比例略有升高。推测BnGPAT6在油菜中的功能与含油量关系不大,可能参与几丁质、软木脂等物质的生物合成途径。     

基于FAE1和FAD2基因的油菜种子脂肪酸生物合成遗传调控

脂肪酸延伸酶1基因FAE1和Δ~(12)-脂肪酸脱饱和酶基因FAD2是植物脂肪酸生物合成途径中的两个关键酶基因,在同一甘蓝型油菜品种CY2中对这两个关键酶基因进行单表达和双表达遗传调控获得五种不同类型的具有相同遗传背景的转基因株系。本研究分析比较了种植于相同环境条件下的五类转基因株系及野生型对照的种子脂肪酸组成和含油量,结果表明,两基因单独和双重调控可显著改变油酸、亚油酸、亚麻酸、花生烯酸和芥酸等多种脂肪酸含量,其中两个内源目标基因同时沉默种子中的油酸含量从20.5%提高到了82.8%,拟南芥FAE1基因籽粒特异表达种子中的芥酸含量由43.9%增加到了60.2%。与野生型对照相比,五类转基因种子中的十八碳不饱和脂肪酸相对比率和油酸脱饱和比例均发生了显著变化。此外,增强FAE1基因表达后种子含油量有所提高,而沉默两个目标基因的表达则使种子含油量降低,表明两个关键酶基因调控对油脂合成与积累也产生一定影响。     

甘蓝型油菜皖油20号种子不同部位油脂合成的转录调控分析

甘蓝型油菜是主要的油料作物之一,种子含油量一般在35%～50%。油脂主要储存于油菜种子胚中,胚主要由子叶[包括外子叶(OC)和内子叶(IC)和胚轴(EA)]组成。低芥酸油菜品种皖油20号(WY20)种子不同部位的含油量存在显著差异。WY20的胚中, OC含油量最高, EA含油量最低。同时,脂肪酸组成在种子不同部位也存在差异, EA中棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)及二十碳酸(C20:0)的比例均显著高于子叶,特别是C16:0在EA中的比例约为子叶的2倍。而油酸(C18:1)及二十碳烯酸(C20:1)在子叶中的比例均显著高于EA。硬脂酸(C18:0)在OC中含量最低,在IC和EA中无差别。亚麻酸(C18:3)则在OC中含量最高,在IC和EA中无差异。对发育34d种子的IC、OC和EA进行转录组分析,将三个部位中基因表达定量分析的结果两两比较后共发掘出7192个差异表达基因,其中OC和IC之间差异表达基因数目较少,子叶和EA间有较多的差异表达基因。子叶和胚轴中的差异表达基因富集在光合作用、脂肪酸代谢和叶绿素合成等生物学过程。基因功能注释显示,差异表达基因中有355个和脂质代谢相关,且多集中在质体中脂肪酸从头合成途径。本研究表明油脂合成途径关键基因的差异调控是造成油菜种子不同部位含油量和脂肪酸组成差异的主要因素。     

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列（1138bp）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因保守序列（181bp）,将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5＇末端,以反向的方式连接到该内含子的3＇末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3＇末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

不同关键酶基因在油菜种子发育进程中的表达

不同关键酶基因在甘蓝型油菜种子发育过程中对油脂积累的影响重大。为此,本实验选取3个不同含油量的甘蓝型油菜作为模型。研究BnACC1、BnDGAT1和BnPDAT1基因在甘蓝型油菜种子发育时期的表达模式。结果表明:BnACC1在这三种甘蓝型油菜种子中的基因表达模式基本一致,在低含油量油菜的种子发育前期和高含油量油菜的种子成熟期相对表达量高,说明在油脂积累旺盛期该基因的高表达可提高含油量;而BnDGAT1和BnPDAT1在这三种甘蓝型油菜表达模式存在差异。其中,BnDGAT1基因在高含油量油菜中的相对表达量高于低含油量油菜。这说明BnDGAT1基因对油脂积累有一定的促进作用。BnPDAT1基因的相对表达量与甘蓝型油菜含油量密切相关。本研究可以为提高油菜含油量的相关分子机制提供了科学依据。     

甘蓝型油菜2个GPAT6同源基因的克隆与表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油生物合成的关键酶,催化三酰甘油合成的起始步骤,在植物中参与调节生长发育、脂质的合成和逆境应答等过程。本试验通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种湘油15中克隆得到GPAT6基因的2个拷贝,分别命名为BnGPAT6-1(GenBank登录号为KJ000117)和BnGPAT6-2(KC106728)。它们的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)均为1506 bp,编码501个氨基酸。预测其蛋白结构N端含有一个类卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase,HAD-like)活性结构域,C端含有一个溶血磷脂酰基转移酶(lysophospholipid acyltransferase,LPLAT)功能域。蛋白序列比对和进化树分析表明,甘蓝型油菜与白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南芥(A.lyrata)中的GPAT6序列相似性最高。组织表达结果表明BnGPAT6基因在花中的表达量最高,在未成熟的胚中表达量呈先升高后降低的趋势。BnGPAT6的表达受ABA的抑制;在干旱和6-BA胁迫下几乎同时升高;在盐胁迫下,短时间内升高,达到峰值后降低;在水渍条件下没有明显变化。     

不同含油量油菜籽代谢物差异分析

高含油油菜可提高单位面积产油量,因而受到广泛关注,但不同含油量油菜种子中代谢物的差异尚未清楚。本研究以2个含油量不同的甘蓝型油菜近等基因系授粉后20～35 d种子为材料,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析不同含油量材料间代谢物差异。以低含油量材料为对照,共筛选出46种差异代谢物,其中24种与油脂合成通路相关,14种与脂肪酸合成通路相关,3种与糖代谢相关,2种与维生素代谢相关,1种与激素代谢相关,2种与花青素代谢相关。高含油油菜种子种固醇、花青素、硬脂酸、亚油酸等脂肪酸较高,亚麻酸含量较低。该结果有助于揭示油菜种子中油脂合成的机制,可为高含油油菜育种提供参考。     

甘蓝型油菜乙酰转移酶基因的克隆及功能验证

为探究乙酰转移酶基因对甘蓝型油菜脂肪酸代谢的影响,以低亚麻酸油菜20～35 d自交种cDNA为模板,克隆了乙酰转移酶基因(Acetyltransferase gene,AT)的2个拷贝(114和148),并进行生物信息学分析以及构建了过表达载体和干扰载体,并转化拟南芥,经潮霉素筛选T_0种子,PCR鉴定抗性苗后,收获T_1种子,用气相色谱法检测T_1种子脂肪酸组成。结果显示,114编码的蛋白偏中性而148编码的蛋白偏碱性,114与148编码的蛋白均为稳定蛋白,亲水性差,属于脂溶性蛋白,且定位在细胞质,无跨膜结构;AT基因的2个拷贝114与148对饱和脂肪酸的转化有影响,114基因与148基因在脂肪酸代谢途径中,抑制软脂酸向硬脂酸转化。过表达114与148基因均会导致软脂酸和亚油酸含量的增加,硬脂酸含量的减少;过表达114基因,会使花生烯酸含量下降,干扰148基因的表达会导致芥酸含量的增加,结果表明,这2个拷贝对改良甘蓝型油菜脂肪酸成分作用明显。     

陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化

异质型ACCase催化乙酞CoA形成丙二酞辅酶A是植物脂肪酸合成途径中的第一个关键的步骤,也是限速步骤:植物体内过量表达ACCase能够增加脂肪酸合成的底物,有可能导致植株种子含油量的增加.本实验采用GUS基因瞬时表达检测棉花愈伤组织中种子特异性表达启动子AGP的活性;利用RT-PCR扩增,克隆了陆地棉异质型ACCas...