白菜雄性不育相关新基因BcMF1的分离及特征分析

【目的】筛选与白菜雄性不育性状相关的新基因,为研究植物雄性不育的分子机制提供依据。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系‘ZUBajh97-01AB ’的表达差异,在可育株群中扩增出1条特异条带BcMF-A15T17,通过RACE和PCR技术扩增得到该基因的cDNA和DNA全长序列,并用Northern杂交验证了该基因的表达特征。【结果】该基因被命名为BcMF1,它的cDNA全长为1 684 bp,基因全长为1 985 bp,BcMF1基因仅在两用系可育株群的中、大花蕾中特异表达。推测的BcMF1蛋白含有471个氨基酸,与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216成员的相似性较高,预测该蛋白是一个定位在胞外的分泌蛋白。【结论】BcMF1基因是一个与白菜细胞核雄性不育相关的新基因。     

棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析

【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因，分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶（BmAK, Bombyx mori arginine kinase）基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。【结果】克隆了BmAK基因, cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸，具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列，酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸；该基因由2个外显子和1个内含子组成；5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ等多个潜在转录因子结合位点，但没有TATA盒启动子序列；该基因的表达在不同组织和不同发育时期存在明显差异。【结论】BmAK具有精氨酸激酶的典型特征，BmAK基因表达随发育时期不同而发生变化，基因的表达可能受蜕皮激素调控。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

中国水仙锌指蛋白NtPLATZ1的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙植物AT富集序列锌结合蛋白基因(NtPLATZ1),为研究该基因的生物学功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆了NtPLATZ1cDNA全长,利用生物信息学方法分析其核苷酸及氨基酸序列,将NtPLATZ1与原核表达载体pGEX-4T-3连接,转化BL21并进行诱导表达,通过半定量PCR分析用多效唑处理后该基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达情况。【结果】NtPLATZ1的cDNA全长1 024bp,包含1个642bp的完整阅读框架,编码213个氨基酸;编码蛋白具有PLATZ superfamily蛋白保守区,与大豆(Glycine max,AII19314.1)PLATZ蛋白序列的同源性最高,为81%。原核表达结果表明,NtPLATZ1在大肠杆菌中能有效表达。半定量RT-PCR分析表明,喷雾多效唑后,NtPLATZ1基因在中国水仙不同生长时期叶片中的表达量先上升后下降,抽葶期叶片的表达量最高;喷雾清水后NtPLATZ1基因表达量先下降后又有所回升,抽葶期和始花期的表达量低于长叶期和盛花期。【结论】成功克隆了中国水仙NtPLATZ1基因,多效唑处理能明显诱导该基因的表达。     

棉花油菜素类固醇合成酶基因GhDWF1的克隆和表达分析

 【目的】研究油菜素类固醇物质（BRs）在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合，从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1 849 bp，包含一个1 692 bp的开放阅读框，推导编码563个氨基酸，与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性，具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强，在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比，无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。     

白菜型冬油菜铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD） 基因的克隆及表达分析

【目的】了解SOD酶蛋白家族Fe-SOD在超强抗寒冬油菜中的表达情况及其在低温胁迫下的作用。【方法】采用RT-PCR技术克隆超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号Fe-SOD的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量以及相对定量RT-PCR研究Fe-SOD在低温胁迫下的表达模式,采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定冬油菜叶片和根中的总SOD酶活性。【结果】获得Fe-SOD,GenBank登录号为KF178713,该基因cDNA片段全长645 bp,包含一个639 bp完整的开放阅读框,编码212个氨基酸的蛋白质,与白菜(Chiifu)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99%。该基因编码的酶蛋白是1个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。Fe-SOD表达模式分析显示初期低温胁迫下（4℃）,该基因上调表达,继续低温胁迫处理（-4℃和-8℃）,Fe-SOD表达量受到抑制。总SOD酶活性测定显示冬油菜根中酶活性高于叶片,以利于冬油菜安全越冬。【结论】从白菜型冬油菜克隆的Fe-SOD具有已知物种Fe-SOD的特征。Fe-SOD在冬油菜品种陇油7号抗寒过程中起作用。     

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

大麦Amy32b的遗传多样性及其对α-淀粉酶活性的影响

【目的】通过对Amy32b遗传多样性研究,发掘与α-淀粉酶活性相关的等位变异。【方法】设计能够覆盖Amy32b序列的特异引物,研究该基因在中国大麦的等位变异类型:单核苷酸多态性位点(SNP)及插入(insert)、缺失(delete)等。利用RT-PCR获得Amy32b的全长cDNA序列,分别将携带等位变异的全长cDNA和截短cDNA连入表达载体pET-28a(+),并对表达产物进行纯化、活力测定及比较研究。【结果】根据对已公布的Amy32b(x05166)的扩增,发现在基因编码区有一多态性位点G/A(cSNP)和1个A碱基的插入/缺失突变。分别位于Amy32b的碱基序列2 269 bp和2 403 bp,其中,G/A转换导致第355位氨基酸由谷氨酸(E)替换为赖氨酸(K);A碱基插入导致终止密码的形成,引发了碱基片段缺失以及编码氨基酸序列和α-淀粉酶蛋白C端的提前终止。克隆出Amy32b全长和截短cDNA,长度分别为1 314 bp和1 266 bp。酶活性测定结果表明,两种全长重组酶(rAmy32b_A和rAmy32b_G)均具有正常且相同的淀粉酶活性,而截短的突变酶(rΔAmy32b)未能测出淀粉酶活性。【结论】Amy32b的碱基插入/缺失突变形成终止子,引发碱基片段缺失和编码α-淀粉酶C端截短,造成酶活性的丧失;而G/A转换造成的氨基酸替换则对该酶活性没有影响。     

Cloning and Expressing of a Gene Encoding Cytosolic Copper/Zinc Superoxide Dismutase in the Upland Cotton

In this study, a gene encoding a superoxide dismutase （SOD） was cloned from senescent leaves of cotton （Gossypium hirsutum）, and its expressing profile was analyzed. The gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends （RACE） method. Northern blotting was used to show the profile of the gene expression, and the enzyme activity was mensurated by NBT deoxidization method in different growth periods. The full length of a gene of cytosolic copper/zinc superoxide dismutase （Cu/Zn-SOD） was isolated from cotton （GenBank Accession Number： DQ445093）. The sequence of cDNA contained 682 bp, the opening reading frame 456 bp, and encoded polypeptide 152 amino acids with the predicted molecular mass of 15.03 kD and theoretical pI of 6.09. The amino acid sequence was similar with the other plants from 82 to 87%. Southern blotting showed that the gene had different number of copies in different cotton species. Northern blotting suggested that the gene had different expression in different tissues and development stages. The enzyme activity was the highest in peak flowering stage. The cotton cytosolic （Cu/Zn-SOD） had lower copies in the upland cotton. The copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing level showed regular changing in the whole development stages; it was lower in the former stages, higher in latter stages and the highest at the peak flowering stage. The curve of the copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing level was consistent with that of the Cu/Zn-SOD enzyme activity. The copper/zinc superoxide dismutase mRNA expressing levels of different organs showed that the gene was higher in the root, leaf, and lower in the flower.     

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。     

杨梅超氧化物歧化酶SOD2同源基因片段的克隆及序列分析

根据植物超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的保守区设计特异性引物,通过RT-PCR技术,克隆杨梅叶超氧化物歧化酶保守区之间的cDNA序列.该序列长233 bp,编码一段由77个氨基酸残基组成的SOD保守区片段,该肽段具有Cu/Zn SOD的特征序列.序列同源性分析表明,该序列与Genba...     

丝瓜铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族的克隆与表达分析

【目的】克隆丝瓜铜/锌超氧化物歧化酶Cu/Zn-SOD基因家族,并分析其序列特征、表达情况及其在丝瓜褐变中的作用,为进一步揭示丝瓜褐变的发生机理提供科学依据,为丝瓜品种遗传改良奠定基础。【方法】通过转录组测序和RT-PCR方法获得丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族的c DNA序列,采用生物信息学方法分析氨基酸序列,利用荧光定量PCR技术研究Cu/Zn-SOD基因家族在不同组织及褐变条件下的表达情况。采用氮蓝四唑(NBT)光还原法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用福林-酚比色测定总酚含量。【结果】获得了3个丝瓜Cu/Zn-SOD基因家族c DNA序列,依次命名为Lc Cu/Zn-SOD1(Gen Bank登录号:KP178922)、Lc Cu/Zn-SOD2(Gen Bank登录号:KX092445)和Lc Cu/Zn-SOD3(Gen Bank登录号:KX092446)。Lc Cu/Zn-SOD1全长758 bp,包含一个456 bp的开放读码框(ORF),编码152个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD2全长799 bp,ORF为471 bp,编码157个氨基酸;Lc Cu/Zn-SOD3全长1 011 bp,ORF为663 bp,编码221个氨基酸;编码的蛋白与甜瓜、南瓜、黄瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息学分析表明3个基因编码的酶蛋白均无信号肽,无跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质。Cu/Zn-SOD基因家族在根中的表达量最高,在花中表达量最低。在丝瓜采后储藏期间,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在丝瓜储藏初期表达量较采后当时(0 d)上调,后期表达量受到抑制;在丝瓜鲜切条件下,3个基因表达量在鲜切后较采后当时(0 h)总体呈下降趋势。相关性分析显示,在采后储藏和鲜切条件下,Lc Cu/Zn-SOD1表达量均与SOD酶活性呈极显著性正相关,Lc Cu/Zn-SOD3表达量均与SOD酶活性呈显著性正相关,SOD酶活性在鲜切条件下与总酚含量呈显著负相关,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在调控SOD酶活性方面起作重要作用,Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3的表达影响了SOD酶活性,并影响了丝瓜褐变进程。【结论】从丝瓜果肉中获得Cu/Zn-SOD基因家族的3个,其中Lc Cu/Zn-SOD1和Lc Cu/Zn-SOD3在普通丝瓜果肉褐变过程中可能发挥着重要作用。     

棉蚜ATP合成酶基因AgoATPb的克隆与表达

为确定棉蚜(Aphis gossypii)ATP合成酶B亚基基因在棉蚜不同组织和日龄,以及取食不同植物的表达情况,以棉蚜为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术获得AgoATPb的全长cDNA序列,通过Expasy、Sig-nalP-4.0 Server等在线工具对其进行了生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技...     

苦瓜MADS盒基因的克隆和表达研究

根据MADS box基因保守区结构 ,设计简并性引物 ,利用 3’RACE方法 ,从苦瓜 (MomordicacharantiaL .)中分离出花特异表达基因的cDNA片段 .同时利用 5’RACE方法获得了全长cDNA ,命名为BAG .序列分析表明 ,该cDNA全长 10 0 1bp ,含一个编码 2 2 8个氨基酸的完整开放阅读框 ,5’端和 3’端非翻译区分别为 5 0、2 6 7个碱基 ,poly(A)尾巴长 2 2个核苷酸 ,具有典型的植物MADS box基因的结构 .该基因编码的蛋白质与黄瓜 (CUM10 ,CAG1) ,棉花(GHMADS 2 ) ,以及拟南芥AGL11等MADS盒基因蛋白质的同源性分别为 :95 %、93%、84 %、72 % .Southern杂交分析显示 ,在基因组中至少有两个拷贝存在 .应用RT PCR和Northern杂交结果证实 ,该基因在心皮和雄蕊中特异表达     

双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD cDNA基因的克隆及序列分析

根据已知多毛类Alitta succinea铜锌超氧化物歧化酶（ Cu/Zn-SOD）基因序列设计引物,利用同源克隆及RACE方法首次从双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis中克隆得到Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列。结果表明：双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD基因cDNA全长870 bp,其中包括156 bp的5′端非编码区,261 bp 3′端非翻译区和453 bp 开放阅读框,编码150个氨基酸;该蛋白序列具有典型的Cu2＋和Zn2＋结合位点,并具有两处Cu/Zn-SOD 蛋白家族标签序列。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于胞内Cu/Zn-SOD,理论相对分子质量为15249900,等电点为5.66,无信号肽和跨膜区,推测为亲水性蛋白。同源性分析表明,双齿围沙蚕Cu/Zn-SOD氨基酸序列与部分软体动物、鱼类和昆虫的Cu/Zn-SOD蛋白序列具有很高的相似性。该研究结果为后续研究Cu/Zn-SOD与环境污染物之间的剂量效应关系奠定了基础,为研究双齿围沙蚕机体的防御机制提供了基础资料。     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。     

仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国北方沿海重要养殖品种之一。克隆了仿刺参profilin基因全长cDNA序列,并分析了基因的表达规律。该基因cDNA序列全长787 bp,5′-非翻译区（5′-untranslated region,UTR）长205 bp,3′-UTR长204 bp,开放阅读框378 bp,编码125个氨基酸,预测蛋白分子量13.4 kDa。仿刺参Profilin蛋白的PROF保守结构域中含有肌动蛋白互作位点、多聚脯氨酸结合位点和PIP2互作位点。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Profilin与丝盘虫（Trichoplax adhaerens）和囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）相似度最高,为46%。Quantitative real-time PCR结果显示,profilin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参11个发育阶段及幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均有表达;在仿刺参的不同发育阶段中,未受精卵至原肠期profilin mRNA表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量增高;在仿刺参的不同组织中,profilin mRNA在体腔细胞中的表达量最高。经过棘皮动物免疫系统有效激活物脂多糖LPS的刺激,体腔细胞中profilin mRNA表达量显著升高,为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。