牡丹SERK2基因的克隆和花芽休眠进程中细胞分裂频率分析

根据牡丹休眠相关的差减文库中筛选得到的类体细胞胚胎发生受体蛋白激酶基因SERK2的部分cDNA片段,采用RACE技术扩增到5′和3′ cDNA片段,通过拼接得到PsSERK2基因2 374 bp的全长cDNA序列,其中5′非编码区（UTR）为158 bp,3′UTR为341 bp,ORF为1 875 bp,编码625个氨基酸。同源性分析得出其与葡萄VvSERK2蛋白同源性最高,为92.95%。PsSERK2在初花期（大风铃期）茎中表达量最高,叶片中最低。Northern杂交和定量PCR结果均表明PsSERK2在低温解除牡丹花芽休眠前期上调表达,而后降低。低温累积过程中,花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加。推测PsSERK2上调表达促进了休眠花芽的发育,进而促进内休眠的解除。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

杧果低分子量热激蛋白基因MiHSP17.6的克隆及表达分析

采用RT-PCR与RACE相结合的方法获得了杧果低分子量热激蛋白基因的cDNA全长序列,命名为MiHSP17.6,GenBank登录号为KJ459857。序列分析显示,该基因序列全长为680 bp,其中开放阅读框为462 bp,编码154个氨基酸,5′非编码区和3′非编码区长度分别为80 bp和135 bp。杧果MiHSP17.6与其他物种的低分子量热激蛋白同源性介于74% ~ 82%。实时荧光定量分析表明,MiHSP17.6在‘四季杧’不同组织器官中均表达,在果实发育的中期表达水平持续上升。高温（44 ℃）、低温（4 ℃）、盐（NaCl）、聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）、双氧水（H2O2）和水杨酸（SA）处理均诱导该基因表达,因此推测MiHSP17.6的功能可能与杧果果实发育和抵御逆境胁迫相关。     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

狗蔷薇细胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的克隆及表达分析

利用RACE 技术从狗蔷薇（Rosa canina）类根体中克隆得到1 个细胞分裂素氧化酶基因cDNA全长,命名为RcCKX5。序列分析表明,RcCKX5 cDNA 全长1 815 bp,5′ UTR 104 bp,ORF 1 626 bp,3′ UTR85 bp,编码541 个氨基酸,具有CKX 家族典型的FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合域和CK（细胞分裂素）结合域。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示RcCKX5 与可可TcCKX5 亲缘关系最近,与拟南芥AtCKX5、乌拉尔图小麦TuCKX5 同源性较高。荧光定量PCR 分析表明,狗蔷薇RcCKX5 在其根、茎、叶、花、果实中均有表达,根中相对表达量最高,花和果实中相对表达量较高。在狗蔷薇类根体形成发育过程中RcCKX5 的相对表达量不断升高,21 d 时达到最高,随后稍有下降,表明其可能参与了类根体的形成。6-BA 处理结果表明RcCKX5 能够快速响应6-BA 的诱导,表达量显著上调,2.5 mg · L-1 6-BA处理120 h 时,RcCKX5 的相对表达量达到最高峰。     

红穗和白穗醋栗F3H的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析

以红穗醋栗（Ribes rubrum L.）和白穗醋栗（R. albrum L.）果实为试材,采用RACE方法克隆黄烷酮3–羟化酶（F3H）基因cDNA全长序列,分别命名为RrF3H和RaF3H（KU984435和KU984436）。RrF3H全长1 351 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸;RaF3H全长1 291 bp,开放阅读框长1 098 bp,编码365个氨基酸。氨基酸多序列比对表明该基因编码的蛋白具有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ_Oxy加氧酶结构域）,属于双加氧酶超家族。系统发育分析表明,RrF3H和RaF3H在进化上具有明显种属特性,属于相对独立的进化分支。定量PCR分析表明,F3H在红穗醋栗中表达量远远高于白穗醋栗,在红穗醋栗中随着果实着色加深表达量逐渐上升,果实着色约75%时表达量最高,之后下降;白穗醋栗中随着果实生长,该基因的表达下降,花色苷含量也呈下降趋势,说明F3H基因在醋栗果实着色过程中发挥作用。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

柑橘半胱氨酸蛋白酶基因CsCysP的分离、亚细胞定位及表达分析

以‘奥林达’夏橙[Citrus sinensis（L.）‘Olinda’]为材料,采用RT-PCR结合RACE技术从果萼离层中分离到1个半胱氨酸蛋白酶类基因,命名为CsCysP（GenBank登录号：KJ093387）。该基因的cDNA全长为1 485 bp,开放阅读框（ORF）为1 083 bp,推测可编码360个氨基酸残基的多肽。其基因组序列与cDNA比对后显示有3个内含子。分析发现,CsCysP属于papain-like（木瓜蛋白酶,C1A）家族的半胱氨酸蛋白酶,与拟南芥、大豆、烟草、杨树等的同源蛋白有73% ~ 83%的相似性。亚细胞定位结果显示CsCysP蛋白定位在细胞壁上。qRT-PCR结果表明CsCysP在老叶、成熟果实果萼离层和花中的表达量明显高于幼苗的根、茎、叶。CsCysP的表达被脱落酸、高盐和PEG6000诱导,低温、乙烯、芸薹素内酯、水杨酸和甲基茉莉酸可抑制其表达。利用基因工程手段获得了柑橘过表达CsCysP的5个转基因株系。     

低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

在低氮胁迫下，以黄瓜品种津研4 号叶片为供试材料，以cDNA 为模板，依据黄瓜基因组数
据库中Csa002986 基因编码区全序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，克隆得到黄瓜钙依赖蛋白
激酶基因（calcium-dependent protein kinase，CDPK）。该基因全长1 584 bp，编码527 个氨基酸。预测
该基因编码的蛋白是一个稳定的亲水蛋白，无跨膜结构，无信号肽，存在蛋白激酶结合区、EF 手型钙结
合区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点、N 酰基化位点等多个位点。CDPK 基因在不同氮浓度处理下黄瓜
各部位表达分析结果显示，在无氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，其次为叶和茎；在低氮条件下，
CDPK 基因在茎中表达量最高，其次为茎尖和叶；在正常及高氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，
其次为茎和叶。CDPK 基因在叶中的表达模式分析结果显示，在无氮及低氮胁迫下CDPK 基因表达量增加，
随着氮浓度的降低，CDPK 基因的表达量增加并明显高于对照；在高氮胁迫条件下，CDPK 基因的表达量
低于对照。     

蜡梅小GTP结合蛋白基因CpRAC1的克隆及表达分析

以‘小樱桃’文心兰为材料克隆了铁氧还蛋白氧化还原酶（FNR）两种类型基因RFNR（Root-type Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase）和LFNR（Leaf-type Ferredoxin-NADP+ oxidoreductase）。生物信息学分析表明,RFNR与LFNR都属于FNR-like超家族,具有黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）功能结合域,在进化过程中比较保守;两种类型的FNR在氨基酸组成、蛋白结构和构型方面存在明显差异,RFNR比LFNR有更强的保守性。FNR蛋白亚细胞定位结果表明文心兰FNR蛋白都定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,LFNR和RFNR具有器官表达特异性：LFNR更多地在叶中表达,RFNR更多地在根中表达;在软腐病胁迫下LFNR下调响应,RFNR上调响应;两种类型的FNR在盐胁迫以及高温胁迫处理时上调响应,但RFNR响应较快且强度更大;LFNR和RFNR在水杨酸（salicylic acid,SA）处理时轻微波动,茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）处理时呈现单峰反应。文心兰两种类型的FNR基因在不同类型的胁迫中显示相似的和有区别的表达特性,表明其具有不同的胁迫响应分子机理。     

蜡梅快速碱化因子基因CpRALF 的克隆及表达分析

 通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库中获得快速碱化因子基因,命名为CpRALF（GenBank登录号为：JQ217379）。扩增获得的DNA序列与cDNA序列一致,表明该基因不具有内含子,包含一个384 bp的最大开放阅读框,编码一个长127个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有快速碱化因子特有的YIXY、YXRGC和4个保守的半胱氨酸以及双精氨酸结构。实时荧光定量PCR分析表明该基因在蜡梅茎、根和盛开的全花中表达量较高;在花发育过程中,蕾期和衰败期表达丰度高。在对蜡梅幼苗进行高温、低温、高盐、重金属4种非生物胁迫处理后,通过实时荧光定量PCR对CpRALF在幼叶中的表达量进行分析,结果表明高温、高盐和重金属能够促进该基因表达,而低温则抑制该基因的表达,且CpRALF对高盐与重金属胁迫的响应比对高温和低温胁迫的响应更为显著和迅速,表明该基因可能在蜡梅花发育以及非生物胁迫反应响应方面发挥作用。     

过量表达杜鹃红山茶CaAPX1的烟草耐热性提高

根据山茶(Camellia japonica)同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3′,5′-RACE技术,从杜鹃红山茶(C.azalea)嫩叶组织中克隆出抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)基因,命名为CaAPX1(Gen Bank登录号:KP635267),基因全长1 097 bp,开放阅读框753 bp,编码250个氨基酸。实时荧光定量分析发现,CaAPX1在4种不同的山茶中均得到表达,其中较耐热的微花连蕊茶(C.minutiflora)表达量最高,其次是中等耐热的杜鹃红山茶和‘耐冬’山茶(C.japonica‘Naidong’),最低的为耐热性较差的‘恨天高’云南山茶(C.reticulata‘Hentiangao’)。结果表明该基因的表达量高低与测试物种的耐热性有关。CaAPX1在杜鹃红山茶4种组织中均得到表达,表达量由高到低依次为:叶片、花蕾、种胚、花芽,其中叶片表达量高达其他组织的1.29~4.26倍。CaAPX1转基因烟草分析表明,过量表达CaAPX1后,APX酶活性提高了2.58~3.81倍,抗坏血酸(Ascorbate,AsA)含量也提高了2.67~3.56倍,并且转基因烟草植株及其种子的耐热能力也提高。     

荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

核桃Y2SK2型脱水素基因JrDHN的克隆、表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和RACE技术从‘香玲’核桃（Juglans regia L.‘Xiangling’）叶片中克隆了1个脱水素基因JrDHN（GenBank 登录号KC503061.1）,其全长1 056 bp,具有528 bp的开放阅读框,编码175个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列,属于典型的Y₂SK₂型脱水素。以核桃18S基因为内参,对‘香玲’核桃JrDHN在4 ℃胁迫下的表达模式进行了初步的研究,结果表明低温诱导下叶片中JrDHN的表达增加,4 ℃处理4 h后达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrDHN表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrDHN在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。‘香玲’JrDHN在雌花中表达量高,其次是叶片和树皮,在花芽中最低。单核苷酸多态性分析JrDHN序列中有30个SNPs位点和11个Indels;单倍型分析显示12份核桃材料可分为10个单倍型,单倍型多样性为0.9697。     

基于银杏花芽3个分化时期转录组测序的相关基因筛选与表达分析

鉴定银杏花芽分化调控的关键基因,揭示银杏花芽分化调控的主要分子机制,为缩短银杏童期和选育银杏早花品种提供理论指导。本研究中采用高通量测序技术对银杏花芽分化3个时期（花芽未分化期、花芽分化始期、花芽分化盛期）的样品进行转录组测序,并分析数字表达谱,筛选开花调控相关基因并进行荧光定量PCR（RT-qPCR）表达验证。转录组测序共产生27.52 Gb原始数据,注释到8大功能数据库（GO、COG、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG）上的 unigene 总数为35 179个。通过GO分类和KEGG Pathway 富集性分析,将unigene分别归于55个GO类别和126个代谢途径。差异表达基因分析显示,花芽未分化期较花芽分化始期有2 253个基因上调,2 032个基因下调;花芽分化始期较花芽分化盛期有1 770个基因上调,1 901个基因下调;花芽未分化期较花芽分化盛期有1 865 个基因上调,2 042个基因下调。发掘出大量的开花相关的基因涉及5个开花调控途径（光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径和年龄途径）。筛选出gene.Gb_17618（GI序列）、gene.Gb_19790（FT/TFL1序列）、gene.Gb_16301（AG序列）、gene.Gb_28337（花发育MADS-box序列）、gene.Gb_01884（SOC1序列）和gene.Gb_41704（CO序列）等6个银杏花芽分化差异表达关键基因序列,荧光定量PCR检测表达水平与转录组结果一致。     

桃成花基因PpLFY的克隆与表达及多克隆抗体制备

 以‘八月脆’桃成花诱导期腋芽为试材,克隆得到一个FLORICAULA/LEAFY同源基因,命名为PpLEAFY（PpLFY）,GenBank登录号为EF175869,该基因cDNA全长1 314 bp,ORF为1 248 bp,编码一个含416个氨基酸残基的蛋白,与其他物种中的LEAFY蛋白的同源性较高,为（74.22%~84.69%）。时期及组织特异性表达分析表明,PpLFY主要在叶片、花瓣及成花诱导期及花芽形态分化初期中表达。构建了pGEX-4T-1/PpLFY原核表达系统,获得了可溶性融合蛋白rPpLFY,分子量约为36 kD。利用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了抗rPpLFY的多克隆抗体,ELISA效价为1:10 000。     

月季RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析

 利用数据库中已发表的拟南芥AtRTE1基因序列,从构建的月季花朵乙烯响应EST数据库中筛选得到一个RTE1同源片段,结合RACE技术,从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为1 233 bp的RTE1同源基因。该基因包含一个732 bp的开放阅读框、339 bp的5′非翻译区和162 bp的3′非翻译区,编码一个243 aa的肽链,其理论分子量为27.6 kD,等电点为6.87。该基因推定的氨基酸序列与拟南芥AtRTE1同源性较高,属于RTE家族中的第1组别基因,命名为RhRTE1。该基因在月季花朵自然开放中表达逐步增强,并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将35S::GFP-RhRTE1融合蛋白转入拟南芥,发现RhRTE1蛋白主要定位于细胞膜上,并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明RhRTE1可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程,并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。     

桃果实PpOAT 和PpP5CS 的克隆及其对外源#br# GABA 处理的响应表达

 利用RT-PCR 结合RACE 技术从‘玉露’桃果实中克隆得到Δ1–吡咯啉–5–羧酸合成酶 （P5CS）和鸟氨酸转氨酶（OAT）基因的全长cDNA 序列,分别命名为PpP5CS 和PpOAT（GenBank 登 录号分别为KP973954 和KP973956）。PpP5CS 全长2 511 bp,开放阅读框为2 151 bp,编码717 个氨基酸 组成的蛋白质多肽,5′-UTR 长度为123 bp,3′-UTR 序列长度为235 bp;PpOAT 全长1 686 bp,开放阅读 框1 416 bp,编码472 个氨基酸,5′-UTR 长度为151 bp,3′-UTR 序列长度为119 bp。进化树分析发现, PpOAT 和PpP5CS 与湖北海棠的同源性最高,与MhOAT 和MhP5CS 的相似性分别达到88%和91%。采 用荧光定量PCR 分析了外源5 mmol · L-1 GABA 处理对桃果实0 ℃贮藏期间果实冷害发生和内源脯氨酸 合成关键基因PpOAT 和PpP5CS 表达的影响。结果表明,GABA 处理能显著抑制‘玉露’桃果实0 ℃贮 藏期间果肉出汁率的下降,减轻冷害。通过上调果实中PpOAT 和PpP5CS 的表达,提高内源脯氨酸的合 成和积累,进而增强了果实抵抗低温胁迫的能力,可能是外源GABA 处理减轻桃果实冷害的重要原因。