洋葱开花相关基因AcLFY 的克隆与表达分析

 以洋葱（Allium cepa L.）品系‘1007’为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR 的方法, 获得植物开花调控关键基因LEAFY 的同源基因的cDNA 序列,命名为AcLFY,GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明,该基因包含1 个1 119 bp 的开放阅读框,编码372 个氨基酸,该氨基酸序列 含有5′-N 端脯氨酸富集区,亮氨酸拉链结构和中央酸性区,具有LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明,该氨基酸序列与水仙的同源性接近70%,与其他高等植物LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示,AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达,在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高,在花器官中只有微 量表达,花器官形成后,主要在叶片中表达。     

番荔枝节律钟输出基因AsGI的克隆、亚细胞定位与表达分析

GIGANTEA基因在植物开花和生理节律变化过程中起着重要作用。利用同源克隆和RACE-PCR的方法获得番荔枝GIGANTEA基因的全长cDNA序列,命名为AsGI,GenBank登录号为KR095281。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsGI基因长为3 465 bp,编码1 154个氨基酸。氨基酸序列比对显示与葡萄和油棕的GI的相似度分别为77%和76%。构建类似蛋白系统进化树显示,番荔枝AsGI与香蕉、海枣、油棕等分子进化距离较近。预测AsGI蛋白为转录因子,定位在细胞核中,为非分泌性蛋白质,不具备信号肽。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草上表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草上表皮细胞的细胞核中有绿色荧光。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的器官中,AsGI的表达量存在差异,在叶片、花蕾和成熟花中的表达量相对较高。AsGI呈现昼夜节律表达模式,长日照下叶片中AsGI在白昼的表达高于短日照处理。在4月、6月和8月,AsGI的表达量相对较高。该基因可能作为番荔枝花期调控分子育种的目标基因。     

光皮桦LFY同源基因的克隆及表达分析

以珍贵用材树种光皮桦（Betula luminifera）为材料,采用同源克隆与RACE的方法,克隆获得LFY同源基因,命名为BlLFY（GenBank号：KP970616）。BlLFY基因cDNA全长1 305 bp,开放阅读框（ORF）长1 212 bp,编码403个氨基酸。基因结构分析显示,BlLFY基因具有2个内含子和3个外显子,与其它植物同源基因具有一致的基因结构。多序列比对和系统进化分析表明,BlLFY基因编码蛋白具有典型的N-domain和C-domain,与板栗（Castanea mollissima）及核桃（Juglans regia）等木本植物的LFY具有最高的同源性和进化关系。进一步的表达模式分析结果表明,BlLFY基因在光皮桦植株进入成年期时表达水平最高,在开花植株的营养器官和生殖器官中均有表达,且贯穿雌、雄花序发育的整个过程,但在雌花序中的表达明显高于雄花序,说明BlLFY基因可能与花期转换和花器官的发育有关,但在雌、雄花序发育过程中的调控作用可能不同。     

草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

三七RNase-like 基因的克隆及表达分析

 采用同源序列克隆法,结合RACE 技术,从三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H]根茎总RNA 中克隆次生代谢相关差异表达RNase-like 贮藏蛋白的编码序列,并进一步以DNA 为模板扩增全长基因, 获得一条开放阅读框为717 bp 的cDNA 序列,命名为PMP（GenBank,KC751542),相应基因全长1 074 bp。序列及其进化分析表明,该基因包含3 个外显子和2 个内含子,编码238 个氨基酸,相应蛋白质的 分子量为27.47 kD,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2 超家族成员。三七PMP 蛋白与人参 RNase-like 贮藏蛋白高度同源,序列相似性达95%。实时荧光定量PCR 研究表明,三七PMP 基因在其根、 茎、叶、花等器官中均有表达,且3 年生根中表达量最高,暗示该基因可能参与三七皂苷次生代谢调控 及其品质形成。     

辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从辣椒（Capsicum annuum L.）花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因,命名为PPI（GenBank登录号：GU812276）。该基因全长952 bp,编码215个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与番茄花器官发育MADS-box基因TPI高度同源,同源性达88%。系统进化树分析表明,PPI基因属于花器官发育B类基因。RT-PCR表达分析表明,该基因在辣椒花瓣中的表达高于在花药、萼片以及子房等花器官中的表达,在营养器官叶片中没有表达。     

桃成花基因PpLFY的克隆与表达及多克隆抗体制备

 以‘八月脆’桃成花诱导期腋芽为试材,克隆得到一个FLORICAULA/LEAFY同源基因,命名为PpLEAFY（PpLFY）,GenBank登录号为EF175869,该基因cDNA全长1 314 bp,ORF为1 248 bp,编码一个含416个氨基酸残基的蛋白,与其他物种中的LEAFY蛋白的同源性较高,为（74.22%~84.69%）。时期及组织特异性表达分析表明,PpLFY主要在叶片、花瓣及成花诱导期及花芽形态分化初期中表达。构建了pGEX-4T-1/PpLFY原核表达系统,获得了可溶性融合蛋白rPpLFY,分子量约为36 kD。利用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了抗rPpLFY的多克隆抗体,ELISA效价为1:10 000。     

基于EST库的枳APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

 根据物种间同源基因相对保守的特点，利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2 cDNA序列作为模板，对柑橘EST数据库进行同源检索筛选，克隆了柑橘APETALA2基因的cDNA序列，并以枳[Poncirus trifoliata (L.) Raf.]花cDNA为模板，根据以上cDNA序列设计特异引物，利用RACE技术分别获得该基因的5'和3'末端，序列拼接后获得枳的APETALA2 cDNA全长。该cDNA全长为1 980 bp，命名为Pt-AP2。Pt-AP2核苷酸序列有一个1 539 bp完整的开放读码框(ORF)，5'末端起始密码子ATG其始于290 bp，3'末端非翻译区为152 bp，其中含有27 bp的Ploy⁺(A)。该基因已在GenBank基因数据库注册，注册号为EU883665。推导该cDNA编码512个氨基酸，与苹果、矮牵牛和拟南芥中相应序列同源性分别为59.1%，59.7%和63.8%。序列分析表明, Pt-AP2除了具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）外，还具有两个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR方法分析Pt-AP2在枳叶、茎、根、花和果等不同器官中的表达水平，结果一致表明Pt-AP2在各个器官中的表达水平不同, 花中的表达量最高，果实中的表达量最低。     

‘冬枣’FT同源基因克隆及表达分析

【目的】克隆‘冬枣’(Ziziphus jujuba Mill.‘Dongzao’)FT基因,预测其功能,明确该基因在‘冬枣’不同组织器官和发育时期的表达模式。【方法】以‘冬枣’为试材,分离克隆‘冬枣’FT同源基因全长序列,命名为Zj FT,运用生物信息学软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用QRT-PCR探究了‘冬枣’FT基因在不同组织以及叶片全生育期的表达模式。【结果】‘冬枣’FT基因编码区为525 bp,共编码了174个氨基酸;理论PI是9.68,分子质量为18.112 ku;系统进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果Md FT基因亲缘关系最近,其次为黑杨Pn FT、荔枝Lc FT、葡萄Vv FT,属于PEBP家族;Zj FT各个氨基酸残基对应的二级结构有α-螺旋(32.7%)、延伸链(23.9%)、β-折叠(8.18%)和无规则卷曲(35.22%),3D结构中有2个α-螺旋和5个β-折叠;Zj FT在枣树不同生长阶段的各个器官中都有所表达,在果实中表达量最高。【结论】从‘冬枣’中成功克隆FT基因,Gen Bank登录号为KR872844,该基因与其他植物的FT蛋白具有高度的保守性;FT基因在枣生殖器官中的表达量高于营养器官,在果实中表达量最高,其次为花;该基因在全年叶片不同月份的表达量随月份降低,呈现逐月下降的趋势。     

文心兰开花相关OnAP1-like基因的克隆及表达分析

以南茜文心兰（Gower Ramsey）盛花期花葶提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE扩增,获得一个958 bp的AP1（APETALA1）-like基因的cDNA全长序列,其基因编码区690 bp,共编码氨基酸229个,命名为OnAP1-like（登录号：KC426946）。蛋白质二级结构分析表明,该蛋白质48.91%为α螺旋,10.92%为β折叠,40.17%为无规则卷曲,为亲水性蛋白质。蛋白序列比对和进化树分析表明,OnAP1-like 蛋白与蕙兰AP1-like蛋白一致性最高,进化距离最近。利用RT-qPCR对从文心兰不同时期不同器官中的OnAP1-like基因表达量进行分析,结果表明,同一器官不同发育时期比较,在叶中,花蕾期的表达量最高;在根中,随发育时间推移,表达量逐渐升高,至花后期达到最高;在花葶中的表达量的趋势与根相同。同一时期不同器官比较,抽葶前,根中表达量高于叶片;花蕾期,花瓣中的表达量最高;盛花期和花后期,花葶中的表达量最高。推测该基因在花的发育及形成中发挥作用。     

荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

苹果NBS-LRR1 基因的鉴定与表达分析

 NBS-LRR 蛋白是植物细胞内普遍存在的主要抗性蛋白家族,该家族的蛋白包含有NBS 结构域和LRR 结构基序,在植物抵御各种病原物的侵袭中发挥重要作用。从‘嘎啦’苹果中鉴定了一个NBS-LRR 类基因,命名为MdNBS-LRR1,（GenBank 登录号：JX126858）。该基因全长为3 116 bp,包含一个2 826 bp 的开放读码框,编码包含941 个氨基酸残基的蛋白质;其氨基酸序列含有典型的NBS-LRR类抗病基因所具有的NB-ARC 结构域。Blast 分析发现MdNBS-LRR1 与大豆NBS-LRR 类抗性蛋白具有较高的氨基酸序列一致性（60%）。RT-PCR 分析结果表明,MdNBS-LRR1 在‘嘎啦’苹果的幼叶、茎、功能叶、芽、皮和花等组织中均有表达,在幼叶中的表达量最高,茎中最低。苹果轮纹病病原菌侵染可促进MdNBS-LRR1 基因表达上调,接种后24 d 表达量最高,是对照的10.6 倍左右,另外,在‘嘎啦’苹果幼苗叶片中,SA、MeJA 和ACC 均可诱导该基因的表达,表明MdNBS-LRR1 基因的表达受到与抗病相关信号转导途径的调控。     

苹果‘长富2号’开花调控转录因子基因MdSPL6的克隆及表达分析

以‘长富2号’苹果短枝顶芽为材料,采用RT-PCR方法克隆得到1个候选开花调控转录因子基因SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL),含有570 bp开放阅读框,编码189个氨基酸。序列比对发现,该基因含有一个保守的SBP结构域和核定位信号,属于SBP转录因子基因家族。系统进化分析表明,MdSPL6蛋白的核苷酸序列与拟南芥AtSPL3、AtSPL4和AtSPL5具有较高的同源性。实时定量PCR分析结果表明,在不同的组织中MdSPL6的表达量存在差异,在叶片和顶芽中的表达量相对较高。易成花的‘烟富6号’苹果短枝顶芽内MdSPL6的表达高于难成花的‘长富2号’。外源GA处理诱导MdSPL6的表达在花后40和60 d下调;6-BA处理使MdSPL6的表达呈现先上升后下降趋势;蔗糖处理促使MdSPL6表达上调。推测MdSPL6对激素和糖信号介导的成花诱导有重要作用,可作为调控苹果花芽分化的目标基因。     

苹果‘长富2号’开花调控转录因子基因MdIDD7的克隆及表达分析

以‘长富2号’苹果为试验材料,采用RT-PCR的方法,从其芽中克隆得到INDETERMINATE DOMAIN(IDD)转录因子基因MdIDD7,其开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。序列比对和结构域分析表明,该转录因子含有1个核定位信号和4个高度保守的锌指蛋白结构域。系统进化树分析表明,MdIDD7与白梨(Pyrus×bretschneideri,XP_009364602.1)、桃(Prunus persica,XP_007225628.1)和梅(Prunus mume,XP_008220893.1)聚在一起。实时荧光定量PCR表明,MdIDD7在‘长富2号’不同组织(茎、叶、花、果和芽)中均有表达,其中芽的表达量最高。花后40~60 d,MdIDD7在易成花品种‘烟富6号’芽中表达量显著高于难成花品种‘长富2号’。"小年"树顶芽组织中MdIDD7的表达量显著高于"大年"树。在花芽诱导前期,外源GA处理诱导MdIDD7下调表达,而蔗糖处理诱导其上调表达,说明MdIDD7响应激素和糖信号,促进苹果成花。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

水仙温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL的克隆与表达分析

采用PCR法,从水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）鳞茎主芽中分离克隆到1个温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL。该基因含有567 bp开放阅读框,编码188个氨基酸。该基因属于lipocalin-2 superfamily基因家族;推导的氨基酸序列含有SCR1、SCR2和SCR3 3个植物lipocalin的典型结构域,与小麦、拟南芥等植物的同源性大于75%;编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白,不含有信号肽,进行N末端朝外由外到内的跨膜运动。qRT-PCR结果分析表明,水仙生长发育过程中鳞茎膨大期NtTIL表达量较低;休眠期表达量先升高后降低。推测NtTIL对水仙鳞茎主芽休眠具有一定调控作用。     

百子莲开花相关基因ApFT的克隆及表达分析

采用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）方法得到了百子莲（Agapanthus praecox ssp. orientalis）FT基因cDNA全长序列,命名为ApFT,GenBank登录号为KC951108。序列分析表明,百子莲ApFT基因cDNA全长815 bp,其中开放阅读框534 bp,编码177个氨基酸,5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR）分别为89 bp和192 bp。ApFT编码的蛋白有一个单一而非常保守的PEBP（Phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP磷酸乙醇胺结合蛋白）结构域,与玉米（MFT2）、拟南芥（AtFT）和温州蜜柑（CuMFT1）等植物的FT蛋白有较高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,百子莲ApFT与玉米（MFT2）聚类关系最近。实时荧光定量qRT-PCR结果显示,整个花芽分化过程中ApFT在叶片中表达量高,茎尖中表达量低。随着花芽分化的进程,在叶片中ApFT表达量逐渐降低,而茎尖中ApFT的表达量在诱导期均高于营养期和花芽分化期,推测该基因可能在调节百子莲花芽分化过程中发挥重要作用。