基于叶绿体DNA信息的南方梨属种质的遗传多样性和演化分析

选取5个叶绿体DNA非编码区trnL-trnF-1、trnL-trnF-2、trnS-psbC、accD-psaI、rps16-trnQ和1个基因区域rbcL,对中国秦岭淮河以南地区的梨（Pyrus L.）资源进行遗传多样性和演化分析。将188份梨资源的测序结果整合得到长度为5 612 bp（包含缺失片段）,共检测出13个单倍型、4个单一突变位点、16个简约性信息位点和14个插入/缺失片段（InDels）,单倍型多样性Hd为0.7178,核苷酸多样性为0.35 × 10-3。accD-psaI区域的分析结果显示该区域的Hd值最高,为0.7177;rbcL区域的Hd值最低,为0.0317。其中162份梨资源检测出12个单倍型,Hd为0.713,核苷酸多样性为0.29 × 10-3;梨的不同地理群体中湖南省的10个梨地方品种的Hd最高,为0.889;来自贵州省的8个品种的Hd最低,为0。138份砂梨地方品种共检测出8个叶绿体单倍型,其中单倍型H2、H4和H5在130份砂梨和37份白梨品种中检测到,单倍型H6、H10、H11、H12和H13在8份砂梨地方品种‘青皮钟’、‘甜宵梨’、‘细花红梨’、‘惠阳红梨’、‘麝香梨’、‘塘湖青’、‘红粉’和‘横县浸泡梨’中检测到。Median-joining Network图显示单倍型H6和H11为古老单倍型,H1、H4和H5为较进化的单倍型。根据叶绿体DNA序列变异信息可推测秦岭淮河以南地区的砂梨和白梨亲缘关系较近,同时来自湖南地区的砂梨种质资源具有丰富的遗传多样性。     

基于叶绿体DNA分析的楸子种质遗传多样性研究

利用4对叶绿体DNA引物扩增49份楸子[Malus prunifolia（Willd.）Borkh.]种质资源的4个叶绿体DNA基因间区trnH-psbA、trnS-trnG spacer + intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF序列，基于4个叶绿体DNA基因间区的序列变异，从母系遗传的角度评价楸子的遗传多样性水平。结果显示：4个叶绿体DNA基因间区序列经测序、拼接、比对和合并之后的片段长度为3 790 bp，共有173个多态性变异位点，其中包含2个单一突变位点、20个简约信息位点和151个插入/缺失位点。在49份楸子种质中，trnH-psbA、trnS-trnG spacer + intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF区域的变异位点的数量分别为26个、25个、120个和2个，单倍型数量分别为9个、7个、8个和3个，合并之后的叶绿体DNA片段的单倍型有14个。核苷酸多样性和单倍型多样性最高的区域均为trnH-psbA（Hd = 0.775，Pi = 0.02143），最低的为5′trnL-trnF（Hd = 0.481，Pi = 0.00072）。49份楸子种质4个叶绿体DNA区域合并后的遗传多样性较高（Hd = 0.854，Pi = 0.00949）。Tajima’s D检验中，4个叶绿体DNA区域在P > 0.10水平上均不显著，楸子的4个叶绿体DNA区域在进化上遵循中性进化模型。楸子的遗传变异主要存在于群体内部，不同居群间基因交流频繁，多数居群间遗传分化较少，与地理距离不完全相关。     

梨主栽品种叶绿体高变区accD-psaI的遗传多样性研究

梨叶绿体DNA结构高度保守,利用其非编码区的高变区域accD-psaI,从母系遗传的角度评价梨主要栽培品种的遗传多样性和亲缘关系,为梨育种计划亲本的选择提供参考。结果显示,42个梨品种的叶绿体高变区域accD-psaI的扩增片段长度为653~932bp,其中简约信息性突变位点3个,占片段总长的0.32%,插入/缺失片段(INDEL)为6个,总长280bp,占片段总长的30.04%。42份材料共检测到6个单倍型,单倍型多样性Hd为0.78,不同梨系统Hd的变化范围在0.29~0.80之间,秋子梨和西洋梨栽培品种的Hd最低,为0.29,种间杂交新品种的的Hd最高,为0.80。白梨、秋子梨、沙梨、新疆梨、西洋梨和种间杂交品种的单倍型个数分别为3、2、2、3、2和3。中介网络图显示,单倍型H1和H3,H5和H6的亲缘关系近。研究结果为育种计划亲本的选配提供参考依据。     

苹果属15个种的叶绿体DNA变异与遗传分化

【目的】利用叶绿体基因(cpDNA)标记,对近十年间在我国苹果属植物的主要密集分布区收集的15种苹果属植物的叶绿体DNA进行序列变异分析,开展其遗传分化和遗传结构研究。【方法】利用4对叶绿体DNA引物扩增722份种质的4个非编码区trn H-psb A、trn S-trn G spacer+intron、trn T-5’trn L和5’trn L-trn F,对每个基因间区正反向测序获得的序列进行人工校对后,使用MEGA 7.0进行序列拼接和比对,使用Dna SP ver5.10.01计算叶绿体DNA的遗传多样性参数,利用Arlequin v3.5分析标准分子变异(AMOVA),运用Net Work ver4.6.1.2构建种内居群间的叶绿体DNA单倍型邻接网络关联图。【结果】4个cp DNA区域经测序、拼接、比对和合并之后的片段长度为4 120 bp,共有579个多态性变异位点,单倍型为100个,核苷酸多样性(Pi)和单倍型多样性(H_d)分别为0.008 52和0.879。Tajima’s D检验中,15种苹果属植物的4个cp DNA区域合并后遵循中性模型。AMOVA分析表明,遗传变异主要存在于种群内,但种群间遗传变异也占较大比重。【结论】中国原产苹果属植物在叶绿体DNA水平具有较高的遗传多样性,苹果属植物不同种具有不同的演化路线,各个种间以及种内起源演化关系错综复杂。山荆子和新疆野苹果的部分种质占据较为古老的单倍型,并在发展演化过程中经历过种群扩张。苹果属栽培种中国苹果、花红、楸子和八棱海棠的部分单倍型晚于部分新疆野苹果的单倍型。     

云南芋种质资源遗传多样性的AFLP分析

 采用荧光标记引物的AFLP分子标记技术, 用筛选出的“3 + 2”引物组合, 对48份云南芋种进行遗传多样性分析, 3对引物共扩增出184个DNA位点, 平均每对引物可检测出56.3个多态性位点,多态性位点高达91.8% , 云南芋种质资源在DNA分子水平上表现出极为丰富的遗传多样性。聚类分析表明: 野生种质和栽培种质的亲缘关系较远, 栽培种质基于AFLP标记的分类结果与形态性状基本一致, 少数材料差异较大。     

福建省梨地方品种的遗传多样性研究

利用叶绿体DNA非编码区序列acc D-psa I和17对SSR引物对原产于福建省的49个梨地方品种的遗传多样性进行分析,旨在为育种利用提供参考。获得49份福建地方品种的acc D-psa I序列,并检测到4个多态性位点,包含5个叶绿体单倍型(Hap1~Hap5),其中核苷酸多态性(Pi)为0.00139,单倍型多样性(Hd)为0.660。TCS网络图显示Hap5是最古老的单倍型,其仅在两个样品中检测到。17个SSR位点共检测到211个等位基因位点,有效等位基因数(A)为5~23个,平均值为12.41;观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的平均值分别为0.5802和0.7549;17个SSR位点的Shannon’s信息指数(I)值为0.5830~2.7683,平均值为1.8661,表现出较高的遗传多样性。基于Nei和Li的遗传距离的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)将49份样品聚为9个组,其中大部分聚类结果与单倍型类型表现的亲缘关系较为一致。叶绿体单倍型和SSR多态性位点信息证实福建地方品种具有较为丰富的遗传多样性。     

基于cpDNA变异对中国梨野生资源的遗传多样性研究

利用叶绿体非编码区的高变区域accD-psa Ⅰ,以111份梨野生资源及32份作为对照的梨栽培品种为研究对象,对其遗传多样性、亲缘关系及起源演化进行分析。结果显示,扩增片段总长为676～980 bp,共检测到由6个碱基替换、8个插入/缺失组成的14种单倍型。单倍型多样性Hd为0.803 2,单倍型多样性标准差Sh为0.125。中介网络图显示单倍型H_8为原始单倍型,仅在6份杜梨中检测到,杜梨可能是梨的原始种。研究结果为中国梨野生资源收集保存及合理利用提供理论依据。     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10（含抗晚疫病基因R10）、四倍体马铃薯栽培种Katahdin（不含已知抗病基因）及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记：RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

苹果EST-SSR引物的开发及部分品种亲缘关系分析

【目的】开发苹果EST-SSR引物,评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用NCBI数据库中苹果EST的SSR位点开发了35对EST-SSR引物,建立了苹果EST-SSR体系,并利用筛选出的16对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118份基因组DNA共扩增出等位基因位点138个,位点数的变化从3到13不等,平均每对引物检测到8.62个位点,总的多态性比率为94.2%,各引物的多态性比例分布为81.8%～100%,相似系数为0.48～1.00。利用UPGMA法构建聚类树状图,在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为5大组:其中第1组又可分为2个亚组,包含了绝大部分供试材料;第2、3、4和5组包含的品种数目分别为12个、11个、3个和2个;第5组与其他组亲缘关系较远,相似性系数仅为0.48。【结论】筛选出的16对EST-SSR引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。     

柿野生雄性资源调查及其遗传多样性研究

柿（Diospyros kaki Thunb.）雄性种质资源非常稀缺,系统收集和梳理国内外现有雄性资源,阐明其遗传多样性并揭示其与主栽甜、涩柿品种及近缘种的亲缘关系,对雄性种质资源的高效利用有重要意义。在全国范围内开展柿野生种质资源调查,在湖北、广西、江苏等地发现野生雄性种质资源共计90余份。利用15对SSR引物对47份柿完全雄性资源、2份雄全同株资源和11份中国雌雄同株资源进行遗传多样性分析,以67份完全雌性资源、38份日本资源（其中包括25份雌雄同株资源）以及28份近缘种为对照。结果表明：15对引物共获得144个等位基因和316个基因型,平均每个引物获得9.60个等位基因和21.07个基因型,其中位点ssrDK11/DQ097479 遗传变异程度最高。从地理分布来看,柿雄性资源在适生的野外山区普遍存在,其中湖北木兰山来源的雄性资源遗传多样性最高,陕西省来源的雄性资源遗传多样性最低。UPGMA和ME聚类方法分别将193份资源分为16组和12组,两种聚类结果反映的总体规律类似：（1）各来源地间的野生雄性资源存在着一定程度的遗传隔离;（2）湖北木兰山野生雄性资源被分为遗传关系较远的两类,一类与江西、江苏、湖南野柿及‘火晶’等主栽涩柿品种和‘耀县五花柿’等雌雄同株涩柿品种亲缘关系较近,另一类与云架山雄性资源和罗田甜柿（包括‘甜宝盖’）亲缘关系较近;（3）大部分日本来源的柿资源可被单独聚为一类。     

甘肃中部梨种质资源的AFLP分析

采用AFLP分子标记技术对甘肃中部梨种质资源的遗传多样性进行分析。结果表明,6对AFLP引物在40份甘肃梨种质中共扩增出472条带,其中多态性带为404条,多态率高达86%,显示了甘肃中部梨资源丰富的遗传多样性。任何一对引物可以鉴别所有40份资源,显示了很高的鉴别能力。采用UPGMA聚类分析法构建的系统树在相似系数为0.72时将40份种质分为7个组:西洋梨、新疆梨、白梨(砂梨)、木梨、褐梨组和2个秋子梨组。所有白梨品种与唯一的砂梨品种黄花梨聚为一个大组。形态学上归属不明的品种分别聚类到西洋梨、白梨、木梨和秋子梨组中。研究表明基于AFLP标记的梨资源分类体系可以反映甘肃地方梨品种和类型间的遗传多样性和亲缘关系。     

基于多种DNA序列的霉梨起源初探

为了探索霉梨（Pyrus spp.）品种群的起源,基于叶绿体片段（accD-psaI,trnL-F）及低拷贝核基因LEY2第二内含子（LFY2int2-N）DNA序列信息对相关的梨属植物进行了系统发育分析。结果表明：除了‘小霉梨’,其它样本均为同一种叶绿体单倍型,与大多数砂梨品种的单倍型一样;基于LFY2int2-N的系统发育树显示霉梨和浙江原产砂梨均非单系类群,但两者关系密切;霉梨并非种间杂种,豆梨很可能没有直接参与其起源。     

基于ITS序列的中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃种内遗传多样性及种间关系分析

对中国樱桃[Cerasus pseudocerasus(Lindl.)G.Don](地方种质35份,野生资源35份),欧洲甜樱桃[C.avium(L.)Moench](18份)和毛樱桃[C.tomentosa(Thunb.)Wall.](7份)共95份材料的核糖体内转录间隔区(ITS,internal transcribed spacer)序列进行了测定和分析,以期从ITS的DNA序列变异角度揭示种内遗传多样性及种间遗传关系。结果表明:(1)96条ITS序列比对后长度为712 bp,G+C含量为58.1%,检测到71个变异位点(9.97%),共定义了37个单倍型;中国樱桃、欧洲甜樱桃和毛樱桃的单倍型多样性和核酸多样性分别为0.840和0.00466、0.928和0.00396、0.905和0.00564,中国樱桃中栽培种质遗传多样性明显低于其野生资源;(2)种间遗传关系显示,中国樱桃与欧洲甜樱桃之间的遗传距离较近(0.019),而与毛樱桃遗传距离较远(0.048);(3)邻接聚类和单倍型网络分析显示3个种分别聚为3个分支,种间具有较大的遗传分化。同时,选择3个种的代表单倍型进行其ITS序列的二级结构预测分析,3个种之间ITS1区、ITS2区的二级结构差异较大,最小自由能差异显著,进一步揭示了3个种间的遗传关系较远。综合分析认为,3个樱桃种内均具有较高的遗传多样性,种间具有较大的遗传分化,遗传关系较远,其中毛樱桃与中国樱桃和欧洲甜樱桃的遗传关系均较远。     

仁用杏品种SRAP遗传多样性分析及指纹检索系统的开发

利用SRAP标记对24份仁用杏品种进行了遗传多样性分析。15对引物共扩增出280条带,其中241条为多态性谱带,多态性比率为85.34%;每个引物组合扩增谱带数在13 ~ 24条之间,平均为18.7条;多态性信息含量（PIC）在0.28 ~ 0.65之间,平均为0.51。基于引物Me4-Em4扩增的多态性谱带,构建的指纹检索系统可以区分24个仁用杏品种。根据SRAP扩增结果,利用UPGMA法构建树状聚类图,在相似系数为0.70处可将24个仁用杏品种分为4组,聚类结果与形态分类基本一致。     

濒危植物太行菊与长裂太行菊的ITS序列分析

对太行菊属（Opisthopappus）的太行菊（O. taihangensis）和长裂太行菊（O. longilobus）13个种群的核糖体DNA ITS进行测序,分析不同种、不同种群间的ITS序列差异。结果表明：排序后的ITS序列总长度为682 bp,含有15个简约信息位点;根据ITS序列差异共确定出18种单倍型,太行菊和长裂太行菊种群均表现出高的单倍型多样性和核苷酸多样性;两个种均有独有的单倍型,又有共有单倍型;聚类分析表明18种单倍型形成明显两支,Hn1和Hn8分别位于两支的中心为祖先单倍型。ITS序列将太行菊和长裂太行菊13个种群聚类成一个单源支系,但长裂太行菊中两个种群（林虑山LLS和石板岩SBY）与太行菊种群聚为一支,显示出两种之间存在着基因交流或杂交。在进化过程中,长裂太行菊可能经历了长距离侵殖,太行菊在太行山隆升之前经历了种群的扩张,随着太行山的隆升逐渐形成现今的分布格局。     

核桃Y2SK2型脱水素基因JrDHN的克隆、表达和单核苷酸多态性分析

采用RT-PCR和RACE技术从‘香玲’核桃（Juglans regia L.‘Xiangling’）叶片中克隆了1个脱水素基因JrDHN（GenBank 登录号KC503061.1）,其全长1 056 bp,具有528 bp的开放阅读框,编码175个氨基酸组成的多肽,具有LEA家族成员的特征多肽序列,属于典型的Y₂SK₂型脱水素。以核桃18S基因为内参,对‘香玲’核桃JrDHN在4 ℃胁迫下的表达模式进行了初步的研究,结果表明低温诱导下叶片中JrDHN的表达增加,4 ℃处理4 h后达到最大值;自然越冬条件下,花芽中JrDHN表达量呈先上升后下降的趋势,在12月份表达量最高,推测JrDHN在核桃对低温胁迫响应中发挥重要功能。‘香玲’JrDHN在雌花中表达量高,其次是叶片和树皮,在花芽中最低。单核苷酸多态性分析JrDHN序列中有30个SNPs位点和11个Indels;单倍型分析显示12份核桃材料可分为10个单倍型,单倍型多样性为0.9697。