施氏假单胞菌固氮调控蛋白NifA调节电子传递体rnf1基因簇的表达

施氏假单胞菌A1501中电子传递体基因簇rnf1位于固氮基因岛上,该基因簇的突变造成固氮酶活显著下降。在rnf1基因簇的启动子区含有固氮调控蛋白NifA的保守结合序列,实时定量qRT-PCR分析证实了nifA突变株中rnf1基因簇的表达量与野生型相比急剧下调,暗示着NifA直接参与rnf1基因簇的表达调控。细菌单杂交系统的体内互作实验表明,在大肠杆菌体内NifA与rnf1基因簇启动子存在直接相互作用;进一步的凝胶阻滞试验证明原核表达纯化的NifA蛋白与rnf1基因簇启动子序列存在体外直接结合。上述结果从分子水平上给出了两者间相互作用的直接证据,为深入研究联合固氮基因的表达调控网络奠定了基础。     

根瘤菌中固氮正调节基因nifA的研究

nifA是共生固氮的正调节基因。nifA基因调节固氮基因的表达伴随着一系列信号交换过程,在植物根部形成特定的器官——根瘤,将大气中的N2还原成铵供给植物作为生长的氮源。同时,植物向类菌体提供光合产物和氨基酸作为其生长的碳源。固氮基因在nifA产物NifA激活下表达,固氮过程由此开始。nifA为固氮基因nif/fix的正调节基因。针对nifA基因的位置及其产物NifA的结构和功能作一综述。     

固氮基因nifHDK启动子的功能在大肠杆菌中的验证

近年来,在对肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nifA产物研究的基础上已建立了固氮基因调控的模型。固氮基因(nif)的表达受氮调节系统ntr和nifAL操纵子的两个系统的调控。本实验将固氮基因nifHDK启动子、aphA-6基因和rbcL3’构建aphA-6基因表达盒,克隆到pSK.KmR载体,将其转入到大肠杆菌中验证nifHDK启动子的表达活性。结果表明,只有在转入外源nifA基因时,nifHDK启动子才具有转录活性,aphA-6基因才能表达。验证了NifA蛋白和σ54因子是固氮基因的正向调节蛋白,为下一步固氮生物工程研究提供了理论基础。     

固氮施氏假单胞菌电子传递复合体rnf基因簇的功能鉴定

能量供应是限制生物固氮效率的重要因素,电子传递复合体是生物固氮过程中能量产生的重要组成部分。基因组分析表明,在联合固氮菌施氏假单胞菌A1501基因组中存在两套编码电子传递复合体rnf,分别为基因簇rnf1和rnf2,其中rnf1位于固氮基因岛上,rnf2基因簇位于核心基因组上。为了明确两套电子传递体在生物固氮过程中的功能,分别构建了rnf1和rnf2基因簇的突变株并测定了相关表型。结果发现,在基本培养基中两个基因簇的突变都不影响菌体生长,可能相互之间存在着功能互补;固氮酶活性测定结果表明,位于固氮基因岛中的rnf1基因簇缺失造成固氮酶活下降80%以上,而rnf2基因簇的缺失对酶活无显著影响。进一步采用启动子-lacZ融合表达策略探究了基因簇rnf1对固氮酶结构基因nifH转录的影响,发现rnf1极性突变株中nifH的启动子转录活性仅为野生型的17.59%,推测rnf1缺失造成了固氮条件下能量产生匮乏,胞内碳氮比失衡,进而造成固氮系统表达受抑制。     

蒺藜苜蓿紫色酸性磷酸酶MtPAP3基因在共生固氮中的功能

利用启动子组织表达定位、超表达及CRISPR/Cas9基因敲除等方法对蒺藜苜蓿酸性磷酸酶MtPAP3基因的功能进行研究。结果显示:MtPAP3在蒺藜苜蓿根和根瘤的维管束组织以及根瘤的分生区和侵染区中表达,在低磷胁迫和根瘤中均表现为特异性诱导后的高效表达;超表达MtPAP3能够显著提高蒺藜苜蓿的结瘤数及根瘤固氮酶活,敲除MtPAP3基因能显著抑制根瘤的发育及固氮酶活。结果表明:MtPAP3参与低磷胁迫条件下根瘤中的磷代谢及共生固氮过程。     

固氮施氏假单胞菌全局性调控因子RsmA的进化分析及表达特性研究

RsmA是假单胞菌属高度保守的全局性调控因子,该蛋白可通过与靶基因的mRNA结合影响其稳定性或者抑制靶基因的翻译影响蛋白表达。固氮施氏假单胞菌A1501中发现一个rsmA同源基因及一个可能参与rsmA活性调节的非编码小RNA rsmZ基因。对A1501菌中RsmA及RsmZ的分子进化及表达特性进行了研究。分析结果表明,RsmA与铜绿假单胞菌同源性可达98%,RsmZ具有4个RsmA的结合位点。实时定量RT\|PCR结果显示,rsmA在生长初期具有高表达量,而在指数生长期以及平台稳定期表达量下降。非编码RNA rsmZ的转录水平在整个生长时期未发生显著变化。在碳匮乏条件下,rsmA和rsmZ的表达量都显著下调。在一般胁迫σ因子rpoS突变株中,rsmA的表达未受影响,但rsmZ表达上调了30多倍,说明rsmZ的表达受rpoS的负调控。进一步发现,A1501菌中,rsmA和rsmZ的转录不受转录调控因子gacA突变的影响,这与荧光假单胞菌CHAO和铜绿假单胞菌PAO1的调控模式区别,表明RsmA的转录调控模式在固氮施氏假单胞菌A1501中有其独特性。该结果为进一步探索固氮施氏假单胞中RsmA的功能及其特定条件下的调控机制奠定了理论基础。     

发菜固氮酶nifH基因克隆及其干旱胁迫下的差异表达

通过对发菜固氮酶H亚基基因(nifH)全长进行克隆、原核表达和生物信息学分析,采用qRT-PCR技术,分析不同干旱胁迫下发菜固氮酶基因nifH在转录水平的表达变化。结果表明,根据特异性引物克隆获得长度为894bp的nifH,GenBank登陆号为BankIt1901364(KU886163)。将nifH在大肠杆菌中表达,获得约36ku的外源蛋白。生物信息学分析表明,发菜nifH与已报道的多种蓝藻的nifH及推导的氨基酸序列具有较高的相似性,nifH二级结构和三级结构主要由α螺旋、β-折叠、随机卷曲和β-转角构成。随藻体含水量的逐渐降低,发菜nifH在转录水平上的表达量逐渐增加,固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为进一步研究发菜固氮酶基因的分子结构和发菜响应干旱胁迫的固氮机制及氮代谢过程奠定基础。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

苜蓿根瘤菌转Sm nifA基因研究初报

外源固氮调节基因nifA的导入对根瘤菌的结瘤固氮效率有较明显的促进作用.首先构建带有Sm nifA基因的重组质粒,再利用三亲本杂交技术将重组质粒转移至苜蓿根瘤菌XM-1中,得到组成型表达Sm nifA基因的菌株,侵染苜蓿后,植株鲜重、干重、含氮量、结瘤数、固氮酶活等指标均优于原始出发菌.     

A型魏氏梭菌α毒素羧基端蛋白基因表达与结构分析

利用PCR技术将α毒素羧基端基因CPA251-370克隆到pET-32a载体上,构建了重组表达质粒pXETCPA-C,酶切鉴定和序列分析证实其含有CPA251-370基因且序列和阅读框架均正确。对重组菌株BL21(DE3)(pXETCPA-C)表达的蛋白质进行SDS-PAGE分析,结果表明CPA251-370蛋白表达量占菌体总蛋白质相对含量的16.43%。SOPMA法预测表明CPA251-370蛋白二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其3D结构与α毒素羧基端部分相似。CPA和CPA251-370蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现两者的CD光谱仅有一些微小变化。免疫攻毒试验表明CPA251-370蛋白免疫的小鼠能抵抗最小致死剂量(MLD) 0.5 mL·只~(-1)(活菌数约为5×10~9 cfu)的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。该研究深入阐释了A型魏氏梭菌α毒素的分子结构,为揭示其作用的分子机制奠定了坚实基础。     

固氮施氏假单胞菌RpoN蛋白对鞭毛合成的影响

选择性σ因子σ~(54)(又称为RpoN)参与到许多细菌特定基因的转录起始过程,如氮同化基因、四碳二羧酸转运基因以及鞭毛基因。为了研究施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri,A1501)中σ因子RpoN对鞭毛合成的影响,构建了A1501的rpoN缺失突变株与功能回补株,并对野生型、突变株与回补株的鞭毛结构、swimming运动、生物膜形成、根际定殖能力以及鞭毛基因的表达水平进行了比较分析。结果表明:rpo N突变株丧失了鞭毛结构与swimming运动能力,根际定殖与生物膜形成能力相对野生型分别下降了25倍与10倍;此外,rpoN缺失后A1501中大量鞭毛基因发生显著下调;启动子分析发现RpoN除了可能参与调控Ⅱ级、Ⅲ级鞭毛基因外,还可能调控一级基因fli A以及四级基因fliC。以上结果说明RpoN在不同调控等级影响A1501鞭毛的合成,进而影响该菌运动、生物膜形成、根际定殖这些与水稻建立起联合固氮体系息息相关的过程。     

6-磷酸果糖激酶基因pfkA在施氏假单胞菌中的异源表达及其表型分析

糖代谢在生命活动中具有重要意义,它保证了生物体生命活动所需的物质和能量的供应。葡萄糖作为自然界中普遍存在的最简单的单糖,是生物体的理想碳源。施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501具有广泛的、典型的微生物代谢途径,但是该菌利用葡萄糖的效率很低。基因组分析表明A1501菌缺少糖酵解（EMP）途径中编码6-磷酸果糖激酶的基因pfkA,初步认为这可能是A1501菌不能高效利用葡萄糖的原因。利用穿梭质粒pLAFR3将大肠杆菌的pfkA基因导入到施氏假单胞菌中,通过pfkA基因的异源表达重建A1501菌的EMP途径。测定了重组菌株的糖类代谢能力,结果表明pfkA基因的导入并没有赋予重组施氏假单胞菌更强的葡萄糖及其他糖类的利用能力,说明A1501菌葡萄糖利用的低效率除了缺乏pfkA外,还有其他的因素。研究也发现,导入pfkA的重组施氏假单胞菌对H2O2高度敏感,推测pfkA导入重建后的EMP途径可能影响了该菌的还原力合成,导致菌体对氧化胁迫的耐受能力降低。     

Pseudomonas stutzeri|A1501基因组结构及功能注释

采用全基因组“shotgun”方法完成了固氮斯氏假单胞菌A1501的全基因组序列测定,并进行了基因组结构与功能注释分析。A1501基因组全长4 567 418 bp,含有4 146个ORFs。该基因组中已鉴定了42个编码转座酶的重复序列,这些序列的存在预示着转座现象在A1501菌中非常活跃,预示该菌与其他生物之间基因交流可能比较频繁。比较基因组表明,为了适应特定的生存环境,假单胞菌在基因组结构和遗传信息容量上产生了明显的分化。此外,基因组分析鉴定了A1501环境适应的遗传基础,包括物质转运、信号传导和趋化系统等,这些系统是细菌能够在根际土壤环境中保持竞争力以及能够与水稻形成高效联合固氮体系的关键。A1501基因组的完成为进一步开展功能基因组学和蛋白质组学研究奠定了基础。     

固氮施氏假单胞菌bifA基因的功能分析

环二鸟苷酸(c-di-GMP)是细菌中一种重要的第二信使,能够调控多种生理活动。C-di-GMP由两个GTP分子经环化酶(DGCs)合成,而被磷酸二酯酶(PDEs)降解,在铜绿假单胞菌中bifA基因为降解c-di-GMP的基因,参与了胞内c-di-GMP的浓度调节。以固氮施氏假单胞菌A1501中的bifA基因为研究对象,构建了bifA基因突变株;鉴定了bifA基因在c-di-GMP降解及生物膜形成中的功能。结果表明,bifA基因的突变造成了A1501菌中c-di-GMP的积累,同时增强了菌株的生物膜形成能力。此外bifA突变株运动能力大幅下降。由此推测bifA为c-di-GMP降解的关键基因,通过调节胞内c-di-GMP水平间接参与调控了生物膜形成以及菌体运动等生理活动。该结果为解析固氮微生物的信号传递及环境适应机制提供了理论基础。     

施氏假单胞菌在玉米根际的固氮效率和促生效果研究

非豆科植物根际联合固氮作用广泛存在于水稻、玉米等根际,在农作物节肥增产方面具有巨大的应用潜力。施氏假单胞菌A1501是一株分离自水稻根际的模式联合固氮菌,接种该菌对水稻和玉米均具有良好的促生效果。为了进一步研究根际固氮与促生效果的关系,利用突变型泌铵固氮菌株（1568/pVA3）和转基因氮高效利用玉米品系共同构建高效固氮体系,并在温室条件下进行促生及生物固氮量评价。播种60 d后对玉米生长量和微生物固氮量进行分析,结果表明：固氮施氏假单胞菌接种后氮高效利用和对照玉米品系的地上和地下部生物量都显著高于不接种对照,但是固氮菌接种对氮高效利用玉米和对照玉米的总生物量没有显著影响。氮高效利用玉米接种1568/pVA3菌株后,植株生物量较施肥处理提高25.5%,全氮含量较不接种对照增加39%,15N同位素稀释法测定生物固氮量为0.8 g·株^-1;接种野生型后植株生物量较施肥处理提高24.8%,生物固氮量为0.64 g·株^-1。研究结果表明,通过将固氮菌尤其是泌铵工程菌与氮高效利用玉米建立联合固氮体系可以显著提高根际固氮量和植株生物量,据估算每公顷可节省化肥约23%,而对照体系为7.5%。     

固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501同化硝酸盐代谢基因簇分布及调控研究

固氮施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501在有氧条件下能够利用硝酸盐/亚硝酸盐为唯一氮源生长,表明该菌除了具有固氮和反硝化等氮循环系统外还有同化硝酸盐/亚硝酸盐系统。为进一步阐明该菌同化硝酸盐的代谢机制,利用生物信息学手段分析了硝酸盐同化相关基因的组成及分布情况,并初步研究了同化硝酸盐途径特异性调控关系。结果表明, P. stutzeri A1501中存在两个硝酸盐同化基因簇nasST-nasA-nirBDnasBcobA和nasR-nasFED,分布于基因组不同部位。第一个基因簇中nasS-nasT编码二元抗转录终止因子,nasA编码NarK/NasA家族硝酸盐转运蛋白,nirBD编码亚硝酸盐还原酶,nasB编码同化硝酸盐还原酶,cobA编码参与西罗血红素合成的尿卟啉-Ⅲ C-甲基转移酶;第二个基因簇中nasR编码单一组分抗转录终止因子,nasFED编码ABC型（ATP依赖）硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白。NasS-NasT双组分蛋白调控硝酸盐/亚硝酸盐还原酶基因的转录,NasR调控硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白基因的转录。