一种快速高效提取柑桔样品病原DNA的方法

为从柑桔样品中快速获得高质量的病原DNA,在传统CTAB法基础上，结合热萃取技术，新建立了一种快速提取病原DNA的CTAB简化法。与Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒和传统CTAB法相比，该方法所需时间短，1～2 h即可完成整个提取过程，获得的DNA质量高、产量多。采用上述方法提取黄龙病、溃疡病、褪绿矮缩病等3种柑桔病害样品DNA进行PCR检测，CTAB简化法和传统CTAB法的检出结果一致，试剂盒的检出率稍低。新建立的CTAB简化法，适用于柑桔病害大规模DNA检测。     

应应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究

 以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接并感染黄龙病的5 个柑橘品种叶片为材料, 以草本指示植物长春花( Catharanthus roseas) 和木本指示植物　柑( Citrus reticulata Blanco) 鉴定为基础, 采用改良的CTAB 法提取总DNA , 在此基础上进行常规PCR 与Nested-PCR 检测, 并对特异目的片段进行克隆、测序。试验证明Nested-PCR 比常规PCR 的灵敏度更高。这两种方法均可以检测出未显症的黄龙病材料, 但Nested-PCR 可以在木本指示植物嫁接后40 d 左右、草本指示植物摩擦接种1 个月左右检测到病原;而常规PCR 在木本植物嫁接后60 d 左右、草本植物摩擦接种近2 个月左右才能检测到病原。常规PCR 所能检测到的最低DNA 的量为pg 数量级; Nested-PCR 检测病原DNA 灵敏度约为常规PCR 的104 倍。     

柑橘黄龙病和衰退病的同步PCR和RT-PCR检测

柑橘黄龙病(HLB)和衰退病(CTV)是2种危害严重的世界性柑橘病害,国内外对其病原检测的研究相当多。研究建立了同时检测HLB和CTV的多重RT-PCR体系,从影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行体系优化。结果表明,多重PCR反应的退火温度应优先考虑退火温度高的引物,退火温度高的引物所需浓度要大于相应退火温度低的引物。该体系实现了DNA病原和RNA病原的统一检测,进一步体现了多重RT-PCR的优越性。     

不同方法提取野生荔枝基因组DNA效果的比较

以广东、广西地区的3个野生龙眼的幼嫩叶片为试材,采用SDS法、常规CTAB法和改良2× CTAB法提取荔枝叶片基因组DNA,比较研究从富含多酚、多糖和色素等次生代谢物质的野生荔枝叶片中获得高质量DNA的提取方法.结果表明:采用改良的2×CTAB法提取的荔枝叶片基因组DNA纯度最高、质量最佳,可直接用于荔枝叶绿体DNA trnL-F基因的PCR扩增分析,且扩增后条带清晰.表明改良的2×CTAB方法获得的DNA纯度和产率较高,符合进行野生分子标记的实验要求.     

柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用

柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leafvius,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之-.本研究在柑橘碎叶病毒-步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析.结果表明,该方法检测灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度...     

辣椒基因组DNA提取方法研究

本项研究采用SDS法、CTAB法和高盐低pH法对辣椒(CapsicumannuumL.)叶片基因组DNA进行提取;紫外吸收检测法与琼脂糖凝胶电泳法对DNA的纯度进行检测。紫外吸收检测结果表明,SDS法提取的辣椒叶片DNA具有典型的天然DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,其A260/A280在1.771～1.912之间。SDS法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测得到一条迁移率很低的整齐清晰的DNA谱带,所提取DNA的质量和产率均较高,用该法提取的辣椒DNA进行RAPD分析,DNA扩增效果较好,带形清晰、整齐,说明SDS法提取的DNA分子较为完整,能用作PCR模板来开展辣椒分子水平的研究。     

节瓜基因组DNA提取方法比较研究

以节瓜的成熟干种子、子叶和不同发育阶段的真叶为材料,选用尿素提取法、高盐低pH值法、SDS法和CTAB法等4种DNA提取方法进行比较。结果表明:不同节瓜材料均可以提取到基因组DNA,其中子叶和第1片真叶的提取效果最好;尿素提取法提取种子DNA最为简便快捷,CTAB法提取叶片能得到纯度较高的基因组DNA。经PCR检验,干种子和子叶提取的基因组DNA都可用于PCR扩增。     

辣椒叶片基因组DNA提取方法的研究

本项研究采用SDS法、CTAB1法、CTAB2法及CTAB3法对辣椒叶片基因组DNA进行提取,通过琼脂糖凝胶电泳法与紫外吸收检测法对DNA的纯度进行检测。试验证明几种提取方法均能提取出辣椒叶片的基因组DNA,其中CTAB3法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测得到一条迁移率很低的整齐清晰的DNA条带,所提取DNA的质量和纯...     

南瓜DNA提取方法比较分析

DNA提取是基因克隆、PCR扩增、分子杂交以及遗传多态性分析等实验的基础。Whatman FTA卡已广泛应用于DNA的保存和提取,具有简便和高效的特点。采用煮沸法和FTA法分别提取南瓜(Cucurbita moschata Duch.)根、茎、叶DNA,以常规CTAB法为对照,以期寻找一种简便快捷的DNA提取方法。结果表明,CTAB法适用于南瓜各组织部位的DNA提取,DNA质量最高,PCR扩增的条带清晰,亮度高,但实验操作也最复杂;用煮沸法从叶片中提取的DNA质量相对较好,从根和茎提取的DNA不宜用于PCR反应,实验操作相对简单;FTA法提取的DNA质量较好,PCR扩增的条带清晰,亮度较高,实验操作最简单,是一种最佳的DNA简化提取方法。     

彩色甜椒基因组DNA提取方法的优化

以不同颜色的甜椒为试验材料，采用CTAB法、SDS法、ROSE法和氯化苄法提取彩色甜椒基因组DNA。结果表明，CTAB法所提取DNA的质量和纯度较高，以此DNA为模板进行RAPD—PCR分析，DNA扩增效果较好，带形清晰、整齐，说明CTAB法提取的DNA较为完整，     

柑橘响应黄龙病侵染的韧皮部蛋白2基因CsPP2B15的克隆与表达分析

黄龙病病原菌诱导柑橘筛孔胼胝体过度积累是其致病的一个重要因素。柑橘韧皮部蛋白（Phloem Protein,PP）在筛孔胼胝体积累中起着重要作用。为研究柑橘韧皮部蛋白响应黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染的功能,克隆获得了一个响应黄龙病侵染差异表达的PP基因CsPP2B15的编码区和长1.5 kb的启动子序列,并以高感品种锦橙和耐病品种酸柚老叶和嫩叶为材料,进行基因表达分析。结果发现,CsPP2B15在高感品种锦橙嫩叶中受CLas诱导显著上调表达,而在耐病品种酸柚嫩叶中受CLas诱导显著下调表达,且在叶肉中的表达量显著高于叶脉。嫩叶和嫩梢被认为是柑橘响应黄龙病侵染的早期原初侵染部位。因此,CsPP2B15可能在CLas侵染柑橘早期中起重要作用。CsPP2B15启动子的顺式作用元件预测分析发现,CsPP2B15启动子含有许多与逆境和激素有关的顺式作用元件。进一步构建了CsPP2B15启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata（L.）Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色和GUS酶活性测定均表明,CsPP2B15启动子具有较强的韧皮部组织特异性。     

环割对柑橘叶片衰老的影响

以3年生红黎檬砧‘暗柳橙’（Anliucheng）为试材,研究了环割与环剥对柑橘叶片光合性能及活性氧代谢的影响。结果表明,环割和环剥30 d后均不同程度降低了叶片叶绿素相对含量（SPAD）、净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和细胞间CO2浓度（Ci）,其中环剥处理对叶片SPAD和Pn产生了持续性的影响;环割和环剥在处理的前期均显著增加了叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性;处理30 d后叶片抗氧化物质抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量显著低于对照,随后呈上升趋势,达到一个峰值后缓慢恢复到正常状态;各处理叶片膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量均呈上升趋势,环割2次和环剥处理叶片初期MDA含量显著高于对照,引发柑橘叶片中一系列抗氧化反应,造成其膜脂氧化程度加剧。     

缺镁、铁、硼胁迫对4 个柑橘砧木生长及养分吸收的影响

 通过水培方式分别研究了缺镁、铁、硼处理对枳、香橙、红橘、崇义野橘4种柑橘砧木植株和根系生长及养分吸收的影响。结果表明：缺镁处理下,红橘在株高、叶片数、叶绿素含量、总根长、总根表面积及镁吸收速率等变化中表现出较强的抗缺镁特性,崇义野橘次之,枳、香橙较差;缺铁处理下,香橙在株高、叶片数、植株干样质量、总根体积、总根表面积和铁吸收速率等变化中表现出较强的抗缺铁特性,红橘次之,枳、崇义野橘较差;缺硼处理下,红橘在总根数、总根表面积、总根体积及硼吸收速率的变化中表现出较强的抗缺硼能力,而崇义野橘的地上部较耐缺硼,香橙、枳则表现出不耐缺硼。     

适于AFLP分析用的桃成熟叶片DNA提取方法

以多个野生桃秋季成熟叶片为材料,采用改进CTAB法对其基因组总DNA的提取进行了研究,并与其相应幼叶DNA的提取效果进行了比较分析。结果表明,从野生桃成熟叶片提取的DNA除产量低于幼叶外,DNA的纯度和完整性都较好,D260nm/D280nm的比值均为1.8～2.0,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化;其AFLP分析(引物EcoRI-TA/MseI-CTT)条带清晰,多态性好,说明此方法提取的野生桃成熟叶片基因组总DNA完全适于AFLP分析。     

土霉素处理对Valencia夏橙中淀粉及相关基因表达的影响

黄龙病(Huanglongbing,HLB)会造成柑橘韧皮部坏死堵塞,导致光合同化物运输不畅,淀粉大量积累。在感染HLB的4年生Valencia夏橙病株上分别注入0.1和0.2 g·株~(-1)土霉素(Oxytetracycline,OTC),90 d后运用qPCR检测,病株中HLB病原菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,Las)含量均明显降低,且0.2和0.1 g·株~(-1) OTC处理的效果相当。I2/KI显色及LM观测表明,0.2 g·株~(-1) OTC处理后植株的淀粉含量从注射前的18.58μg·mm~(-2)减少至90 d的5.24μg·mm~(-2),而0.1 g·株~(-1)的处理90 d仅降至11.88μg·mm~(-2)。高效液相色谱(HPLC)检测结果表明,注射后90 d内,试验用浓度0.2 g·株~(-1) OTC在植株体内可降解至200μg·kg~(-1)以下。基因表达结果表明,注射0.2 g·株~(-1) OTC后30和90 d,淀粉合成及分解相关基因表达量均下降,其中淀粉合成相关基因AGPase表达量下降最显著,这与OTC注射后30和90 d叶片内淀粉含量下降结果一致。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

一种从果树成熟叶片提取DNA的方法

针对果树成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢物质的特点,以8个果树树种的秋季成熟叶片为材料,采用改进的CTAB法对其基因组总DNA进行了提取,并对得到的DNA进行了电泳检测、含量测定和AFLP分析。结果表明,该方法从8种果树的成熟叶片中均能提取出基因组总DNA,且DNA的纯度和完整性都较好,D260nm/D280nm的比值均在1.8～2.0之间,无降解现象,RNA去除干净,能被限制性内切酶完全消化;其AFLP分析(引物组合为EcoRI-TA/MseI-CTT,EcoRI-TT/MseI-CTT)条带清晰,多态性好,说明此方法提取的果树成熟叶片基因组总DNA完全适于AFLP分析。     

柑橘病毒类病害诊断技术研究进展

柑橘病毒类病害对世界柑橘产业造成了严重的损失。诊断技术是防控柑橘病毒类病害的重要保障。对指示植物鉴定、电镜技术、血清学方法、核酸杂交、（RT-）PCR以及新近出现的环介导恒温扩增、基因芯片和高通量测序等技术在柑橘病毒类病害诊断中所取得的进展进行综述,并对今后的发展方向进行了展望,旨在为更好地防治柑橘病毒类病害提供借鉴。     

柑橘半胱氨酸蛋白酶基因CsCysP的分离、亚细胞定位及表达分析

以‘奥林达’夏橙[Citrus sinensis（L.）‘Olinda’]为材料,采用RT-PCR结合RACE技术从果萼离层中分离到1个半胱氨酸蛋白酶类基因,命名为CsCysP（GenBank登录号：KJ093387）。该基因的cDNA全长为1 485 bp,开放阅读框（ORF）为1 083 bp,推测可编码360个氨基酸残基的多肽。其基因组序列与cDNA比对后显示有3个内含子。分析发现,CsCysP属于papain-like（木瓜蛋白酶,C1A）家族的半胱氨酸蛋白酶,与拟南芥、大豆、烟草、杨树等的同源蛋白有73% ~ 83%的相似性。亚细胞定位结果显示CsCysP蛋白定位在细胞壁上。qRT-PCR结果表明CsCysP在老叶、成熟果实果萼离层和花中的表达量明显高于幼苗的根、茎、叶。CsCysP的表达被脱落酸、高盐和PEG6000诱导,低温、乙烯、芸薹素内酯、水杨酸和甲基茉莉酸可抑制其表达。利用基因工程手段获得了柑橘过表达CsCysP的5个转基因株系。