响应黄龙病侵染的柑桔韧皮部蛋白2基因筛选及表达分析

为了探索柑桔韧皮部蛋白2(Phloem Protein 2,PP2)在寄主与黄龙病菌互作中的功能,以嫁接传毒后的高感种质锦橙Citrus sinensis和耐病种质酸柚Citrus grandis病枝叶片为材料,通过实时荧光定量PCR方法从全基因组水平初步筛选到6个响应黄龙病侵染诱导的PP2基因,并比较了其在锦橙和酸柚中的相对表达量。结果表明,CsPP2B15可能与耐病有关,CsPP2B2和CsPP2B10可能与感病相关。采用生物信息学的方法对6个基因编码氨基酸序列从结构组成、基本理化性质、亲疏水性进行分析并构建了系统发育树,发现在柑桔中CsPP2B15和CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系较近,而CsPP2B2、CsPP2B10、CsPP2B12-1、CsPP2B12-2与大豆PP2亲缘关系较近,CsPP2A与拟南芥PP2的亲缘关系最近。     

黄龙病菌胁迫下‘锦橙’CsCalS5表达和胼胝质沉积的初步分析

胼胝质合成酶是控制胼胝质合成的关键酶,在植物生长发育和抗逆胁迫中具有重要作用。克隆并分析‘锦橙’胼胝质合成酶基因CsCalS5及其启动子序列,实时荧光定量PCR检测CsCalS5的组织表达模式以及植物生长调节剂、黄龙病菌和柑橘溃疡病菌的诱导表达模式,并通过组织切片观察感染黄龙病和柑橘溃疡病‘锦橙’叶脉胼胝质的沉积。结果显示,CsCalS5启动子序列中含有脱落酸和病原菌的响应元件;CsCalS5编码1952个氨基酸含有保守结构域FKS1和β-1,3-葡聚糖合成酶功能域的跨膜蛋白;CsCalS5在‘锦橙’的茎中高表达,且受脱落酸的诱导;黄龙病菌侵染后叶脉韧皮部的胼胝质沉积明显,患病叶片CsCalS5的表达量是健康对照的4.02倍;柑橘溃疡病菌侵染叶片后,叶脉韧皮部胼胝质沉积无明显增加,且CsCalS5的表达量与健康对照无显著差异。综上,黄龙病菌可能通过上调‘锦橙’CsCalS5的表达促进韧皮部胼胝质的沉积,从而增强其防御能力,且这种抗性可能受到脱落酸的调控。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

柑橘响应黄龙病菌侵染的NAC基因的克隆及表达分析

挖掘柑橘抗黄龙病（Huanglongbing,HLB）基因是抗病育种的基础和关键。以感染黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)早期（2个月）锦橙根和叶片中脉比较转录组数据为基础，筛选到9个响应柑橘黄龙病侵染诱导的NAC基因，从中选3个差异表达水平较高的基因克隆，分别命名为Cs NAC21/22、Cs NAC68和Cs NAC78。生物信息分析表明3个基因均符合NAC基因家族的特征；烟草亚细胞定位结果表明，Cs NAC68定位在细胞核，Cs NAC21/22和Cs NAC78定位在细胞核和细胞质。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明，3个候选基因在易感HLB的锦橙、耐病的马蜂柑和高耐病的九里香的组织和病原菌诱导表达特征呈现明显差异。以健康植株为对照，Cs NAC68和Cs NAC78主要在锦橙的根中响应CLas感染，显著上调表达，Cs NAC68在九里香叶肉和马蜂柑根中响应CLas感染，显著上调表达；Cs NAC21/22主要在锦橙根和马蜂柑叶肉中显著下调表达。以‘锦橙’叶片为试材通过q RT-PCR分析候选基因响应SA、J...     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。     

柑橘黄龙病相关水杨酸羧基甲基转移酶基因CsSAMT-1的克隆与表达分析

为研究水杨酸羧基甲基转移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)在柑橘防御黄龙病(Huanglongbing,HLB)中的作用,克隆获得Cs SAMT~(-1)基因,并以易感HLB锦橙和耐HLB酸柚为试材进行基因表达分析。q RT-PCR结果表明,易感病锦橙中CsSAMT~(-1)在感染HLB后上调表达,且在叶脉中的表达量显著高于叶肉;而耐病酸柚中CsSAMT~(-1)呈组成型表达。外源水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理锦橙和酸柚,均可诱导CsSAMT~(-1)上调表达。HLB侵染前,耐病酸柚叶脉中SA和水杨酸甲酯(MeSA)含量分别为11.85和18.18 ng·g~(-1),显著高于锦橙(0.82和0.01 ng·g~(-1));HLB侵染后,锦橙中SA和MeSA含量明显上升,酸柚中SA含量明显下降,MeSA含量基本保持原有水平。研究表明,Cs SAMT~(-1)可能通过调节SA和Me SA信号分子转换来增强对柑橘黄龙病的抗性。     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

柑橘胼胝质合成酶基因家族的表达分析

胼胝质由胼胝质合成酶合成,胼胝质沉积是植物对入侵病原的防御反应。为了探索胼胝质合成酶(Callose synthase,CalS)基因在柑橘中对黄龙病的应答情况,从甜橙基因组中筛选并利用生物信息学分析了柑橘胼胝质合成酶(CsCalS)家族的12个基因。这些基因编码的氨基酸序列与拟南芥中的胼胝质合成酶具有较高的同源性。荧光实时定量PCR结果显示,CsCalS5和CsCalS12在柑橘健康叶片中的表达量高于其他胼胝质合成酶基因。比较黄龙病感病材料和健康对照材料,发现CsCalS5、CsCalS7和CsCalS8在感病的‘砂糖橘’和‘强德勒’柚中均上调表达,可能参与柑橘对黄龙病病原的应答反应。     

顶空固相微萃取—气质联用技术分析3种柑橘果实的香气成分

采用顶空固相微萃取-气质联用技术对大叶尾张温州蜜柑、锦橙和酸橙3种柑橘果实的香气成分进行分析测定。结果表明,大叶尾张温州蜜柑、锦橙和酸橙果实中分别检测出73、71和66种香气成分,各占总峰面积的85.9%、85.12%、79.82%。主要成分为烃类、酯类、醇类、酮类和醛类化合物。烃类在大叶尾张温州蜜柑中含量最高,酯类物质在锦橙中含量最高,醛类和醇类物质在酸橙中含量最高。3种果实有31种相同的香气成分,独有的香气成分,大叶尾张温州蜜柑15种,锦橙24种,酸橙17种。3种柑橘果实香气成分的种类和含量均存在差异,大叶尾张温州蜜柑的重要特征香气是γ-松油烯,丁酸乙酯和3-羟基己酸乙酯可作为锦橙的重要特征香气,芳樟醇可作为酸橙的重要特征香气物质。     

响应黄龙病侵染的柑橘乙醇脱氢酶基因CsADH1的克隆与表达分析

对前期在感染黄龙病的‘晚锦橙’中发现的明显差异表达的柑橘乙醇脱氢酶（CsADH1）基因进行克隆测序分析，结果表明，CsADH1 的 CDS 序列长为 1 143 bp，编码 380 个氨基酸。蛋白质结构预测显示，CsADH1 含有乙醇脱氢酶 GroES（ADH_N）和 ADH_zinc_N 保守结构域。进化树分析显示，CsADH1 蛋白与拟南芥、蓖麻和中国莲的 ADH 蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示，CsADH1 蛋白定位在细胞质中。以感病‘晚锦橙’的根和叶脉为材料，qPCR 分析显示 CsADH1 在感病根和叶脉中均上调表达，且根中的表达水平是叶脉中的 10 倍。离子胁迫试验和外源植物生长调节剂诱导试验表明，Zn、水杨酸（SA）、生长素（IAA）和脱落酸（ABA）均显著诱导 CsADH1 上调表达，并且根中的表达水平明显高于叶中。本结果表明，CsADH1 可能在柑橘根响应黄龙病菌侵染中起着重要作用。     

分泌型Cecropin B 抗菌肽基因转化血橙提高其抗溃疡病水平

 为了利用Cecropin B（CB）抗菌肽基因提高柑橘对溃疡病的抗性,人工合成了两个含有信 号肽的Cecropin B 抗菌肽基因PR1aCB 和AATCB。洋葱表皮瞬时表达分析表明,与非分泌型CB 抗菌肽 相比,PR1aCB 和AATCB 抗菌肽在细胞间隙中优势积累。进一步构建了CaMV 35S 调控 PR1aCB 和AATCB 基因的植物表达载体,转化塔罗科血橙（Citrus sinensis Osbeck）上胚轴,获得转基因植株。GUS 组织化 学染色、PCR 和Southern blot 分析表明外源基因已成功整合入柑橘基因组。Real-time PCR 定量分析表明, 抗菌肽基因在转基因植株中成功表达。柑橘叶片离体抗性分析表明,转PR1aCB 和AATCB 基因植株的抗 性显著强于非转基因植株,其抗性水平与高抗品种‘南丰蜜橘’（C. succosa Hort. Ex Tan）和‘四季橘’ （C. madurensis）相当。     

高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立

针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点,以柑橘老叶老皮为试材,在传统CTAB提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方,建立了一种快速、简便的提取植物老熟组织及其内部病原总核酸的CTAB-Triton提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强,且解决了传统CTAB溶液因低温析出而致DNA得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部杆菌的检出率,并用该法制备模板,分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况,及对其它几种柑橘病原菌进行PCR/RT-PCR检测。结果表明,CTAB-Triton方法能有效提取柑橘老熟叶片的DNA,所得DNA质量高,产量比商品化试剂盒大,提高了韧皮部杆菌的检出率,且可用于柑橘其他病原真菌、细菌,以及DNA或RNA病毒病害的PCR/RT-PCR检测,也可用于定量PCR检测和病原种群多态性分析。     

黄龙病菌侵染晚锦橙叶脉和根早期病原蛋白组学的比较分析

【目的】黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害,由于黄龙病病原菌无法离体培养,其关键的致病机制仍不清楚。为此,通过蛋白组学分析探究黄龙病菌侵染晚锦橙早期时病原蛋白的表达情况。【方法】利用叶圆片嫁接技术对晚锦橙(Citrus sinensis Osbeck)进行嫁接传毒,在传毒2个月时,对感病后的根和叶脉组织进行蛋白组测序,以黄龙病亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)基因组为参考,对测序结果进行注释,并以感病叶脉为对照,筛选病原菌差异表达蛋白,最后利用qRT-PCR对显著性差异表达蛋白质进行验证。【结果】共鉴定出38个病原蛋白,其中有6个显著性表达差异蛋白;GO功能注释揭示这些病原蛋白主要与核酸结合和物质转运活性相关;qRT-PCR结果显示,6个显著差异蛋白在根部组织中的表达水平显著高于叶片组织;其中ABC转运系统重要组成成分CLasMalE(ACT56611.1)转运蛋白基因的表达倍数高达595倍。【结论】在黄龙病菌侵染柑橘根和叶的早期,与病原菌物质运输和核酸代谢相关基因的表达差异明显,暗示其在黄龙病菌侵染寄主中起着重要作用,为黄龙病菌致病机制研究提供了基因资源和理论基础。