利用实时荧光PCR 方法检测香蕉软腐细菌

 由Dickeya spp.引起的香蕉细菌性软腐病是近年来在中国广东发生的一种严重危害香蕉的病 害,检测方法的建立和应用是防止病害传播和实时防治的重要手段。依据报道的Dickeya spp.通用引物, 建立了用于香蕉细菌性软腐病发病植株和带菌土壤检测的实时荧光PCR 方法。优化后的检测体系对香蕉 软腐细菌（XJ8-3-3）靶片段克隆质粒DNA 的检测灵敏度可达到2.4 × 10^-5 ng · μL^-1,对菌悬液的检测灵敏 度可达到4.0 × 10² cfu · mL^-1,而常规PCR 对其检测的灵敏度为2.4 × 10^-3 ng · μL^-1 和4.0 × 10⁴ cfu · mL^-1, 实时荧光PCR 的灵敏度比常规PCR 高100 倍。利用实时荧光PCR 能够快速的检出香蕉细菌性软腐病发 病植株和带菌土壤中的病原菌量,对梯度稀释的菌悬液接种的带菌土壤检测结果表明,可检测到病菌DNA 最低含量为0.35 pg · L^-1。该方法适用于对香蕉软腐病菌的检测和监控。     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

番茄细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌的四重PCR检测方法

针对引起番茄细菌性病害的细菌性斑点病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst）、溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum,Rs）以及疮痂病菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria,Xcv）,建立了四重PCR检测技术,为病害的快速、准确诊断提供技术支持。根据gap1基因设计Pst特异性引物BW-F/BW-R,经PCR条件优化,扩增出了375 bp的特异性片段。将设计的引物与已报道的3种细菌特异性引物组合,通过设定不同的退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响四重PCR扩增的因素,优化了其反应体系。四重PCR反应体系中的引物对BW-F/BW-R、Fan1/Fan2、RS-1-F/RS-3-R和XCVF/XCVR可分别扩增出细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌长度为375、146、716和517 bp的特异性目的片段,反应体系退火温度为57.1 ℃,4对引物的终浓度分别为0.24、0.16、0.16和0.08 μmol ? L-1,延伸时间45 s,35个循环。该四重PCR反应体系可快速检测田间番茄发病植株中的细菌性斑点病菌、溃疡病菌、青枯病菌和疮痂病菌,灵敏度达到10-1 ng ? μL-1。     

甘肃地区番茄细菌性斑点病菌的鉴定与检测

从番茄病果上分离纯化的细菌菌株,经致病性测定、形态特征、培养特性观察及16S rDNA
序列测定,鉴定为番茄细菌性斑点病菌Pseudomonas syringae pv. tomato（Okabe）Young,Dye et Wilkie。
利用特异性引物对已鉴定菌株及番茄发病组织进行PCR 扩增,均扩增出530 bp 左右的特异性片段,印证
了可利用特异性引物MM5F/MM5R 对分离菌株或番茄发病组织进行PCR 扩增以检测番茄细菌性斑点病菌。     

氰氨化钙土壤消毒对黄瓜根腐病及土壤病原菌的控制效果

应用氰氨化钙土壤消毒技术防治黄瓜根腐病,通过病害防治效果、植株生长情况等指标,结合土壤中茄病镰刀菌实时荧光定量PCR检测手段明确氰氨化钙不同剂量处理后病原菌菌量的动态变化,以此评估氰氨化钙土壤消毒防治黄瓜根腐病的施用效果。应用建立优化的荧光定量PCR检测体系监测土壤中茄病镰刀菌带菌量,最低检测量为1×101个拷贝·g~(-1)。研究结果表明,氰氨化钙最佳施药量为120 g·m~(-2),其茄病镰刀菌消毒3 d菌量大幅下降,9 d时降为0,种植黄瓜苗后菌量恢复缓慢,对黄瓜根腐病防治效果为66.56%~74.41%,植株长势良好。     

番茄细菌性溃疡病菌的定性PCR检测方法

以2个番茄溃疡病菌株和其它6种植物病原菌为试验材料,以micA、cytC、TomA等3个特异性基因为检测靶标,采用检测引物设计与优化、特异性测试、灵敏度测试等方法,研究建立番茄溃疡病菌的定性PCR检测方法。结果表明:依据这3个基因建立的PCR检测方法可特异、精准检测番茄溃疡病菌,其中,以TomA基因为检测靶标的方法灵敏度可达到5copy/μL或103 cfu/mL,优于另外2种方法,为番茄溃疡病菌的早期诊断提供了快速、准确的技术手段。     

一种新的西瓜果斑病种子带菌检测方法

通过采用病原菌分离、培养基富集培养与 PCR 技术建立了一套西瓜果斑病菌检测方法。结果表明,MOPS 缓冲液对西瓜种子所带病菌分离效果最佳,且利用 WFB1/WFB2引物对富集到的病菌进行 PCR 检测,都产生了预期360 bp 片段;对 BFB 纯菌液和模拟带菌种子浸提液的最低检测限为1.0×102 cfu/mL。利用 OD 值法结合平板涂布记菌落数方法绘制西瓜细菌性果斑病病原菌浓度梯度标准曲线：Y=3.9841x+0.0881,R2=0.9991（Y×108 cfu/mL）。该检测方法的建立,为西瓜生产中果斑病防治提供了重要技术支持。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

猕猴桃溃疡病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为建立猕猴桃溃疡病PSA病原菌的实时荧光定量PCR方法,根据hrpW基因设计一对引物P3F/P5R,扩增片段大小为247bp,构建该片段的阳性质粒用于荧光定量PCR标准曲线的制作;评价引物的灵敏度、特异性,并验证其实际应用效果。结果表明,该方法能特异性地检测出PSA病原菌,灵敏度为100fg/μL。以采集的无病症和有病症猕猴桃枝条为样品,本方法可检测到无病症枝条中最低浓度为8.45×10-5 ng/μL的PSA病原菌。本实验建立的实时荧光定量PCR检测猕猴桃溃疡病菌方法可用于猕猴桃溃疡病感病样品的早期诊断,对该病原菌的预防诊治具有重要意义。     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。     

山东地区茄子感染番茄褪绿病毒的分子鉴定

为明确山东地区番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)侵染茄子的情况,采用RT-PCR分子检测鉴定疑似感染To CV的茄子叶片样品及发病茄子植株上的烟粉虱(Bemisia tabaci)体内To CV的带毒情况。结果表明:10份茄子叶片样品中有6份扩增得到约463 bp的特异条带,经测序与Gen Bank中To CV序列相似性达到99.0%以上,To CV检出率为60%;系统进化分析显示,山东寿光地区To CV茄子分离物cp-1与北京番茄分离物BJ亲缘关系最近。温室内发病茄子植株上的烟粉虱体内携带To CV,带毒率为70%。     

番茄褪绿病毒在湖南省首次发生

2016年7月在湖南省蔬菜病害调查中发现,4种茄科蔬菜表现出叶脉间褪绿、叶片黄化等症状,疑似被番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)感染,同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用To CV热激蛋白(heat shock protein 70,HSP70)序列的特异性引物对采集的番茄、茄子、辣椒、马铃薯样品和烟粉虱样品进行RT-PCR检测,均扩增出目标条带,且扩增序列与北京番茄To CV分离物(KC887999.1)部分序列相似度为99.0%,确认采集样品被To CV感染。4种茄科蔬菜To CV的感染率达70%~100%;发病叶片上烟粉虱的带毒率为66.7%~87.5%;鉴定出烟粉虱的生物类型为MED烟粉虱。这是湖南省首次确认该病毒,需要引起关注和加强防范。     

陕西杨凌地区番茄斑萎病毒外壳蛋白基因的克隆与分析

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是世界上危害最大的十大病毒之一，为了确定陕西杨凌地区的番茄感染TSWV 情况，采集该地区4 份疑似感染TSWV 的番茄样品，通过表型观察以及PCR 分子鉴定进行分析。结果显示，2 份材料扩增出234 bp 的特异性条带，表明样品感染了TSWV。采用同源克隆方法获得了杨凌地区757 bp TSWV 的外壳蛋白基因（CP），其与西班牙TSWV 分离物同源性最高，为99%，而与昆明的TSWV 分离物亲缘关系较远。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

河南番茄褪绿病毒的分子鉴定

2014年在河南省郑州、济源、新郑、中牟、扶沟等地发现大量保护地番茄植株的叶脉间出现褪绿症状,疑似由番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)侵染引起。以这5个地区的番茄病叶为样本提取总RNA,利用ToCV HSP70h(Heat shock protein 70 homolog,热激蛋白70家族)基因的特异引物对样本进行RT-PCR检测,均扩增出约460bp大小的目的条带。PCR产物测序和序列分析结果表明,该序列与国际上报道的ToCV HSP70h的序列相似性达到99%以上,表明ToCV是为害河南省番茄产区造成褪绿症状的主要病原之一。     

EMS诱变的‘里格尔87-5’番茄M_2群体突变体表型及其抗坏血酸研究

构建番茄突变体库对于丰富遗传变异、发掘基因资源具有重要意义。利用1%的甲基磺酸乙酯(EMS)处理‘里格尔87-5’加工番茄种子12 h,对M_2代材料进行农艺学性状与生物学性状鉴定,对部分M_3代材料进行遗传稳定性验证。在M_2代筛出典型突变体,包括早衰、矮化、圆果、低抗坏血酸、黑斑、绿茎、簇生等突变单株。对240个M_2代家系中共1 023个单株全生育期田间表型进行观察鉴定和果实品质测定,共发现90个变异单株,其中13个突变单株同时出现两个或两个以上变异性状,共50个变异性状,总的单株变异频率(突变株/总株数)为8.80%。叶、茎、花、果实和植株发生的变异株数分别为27、7、17、56和21,性状变异频率分别为2.64%、0.68%、1.66%、5.47%和2.05%。其中矮化突变体分子鉴定表明,curl-3基因外显子中C变成T,氨基酸由L变成F,喷施油菜素内酯不能恢复其正常生长,表明curl-3突变导致油菜素内酯信号传导受阻。curl-3突变体叶片与果实中抗坏血酸含量下降,并伴随着叶片中氧化态与还原态抗坏血酸比值增加,这可能与抗坏血酸氧化酶基因AO表达量和AO酶活性增强有关。     

高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立

针对柑橘老熟组织中富含多糖、多酚、色素和其它次生代谢产物的特点,以柑橘老叶老皮为试材,在传统CTAB提取法的基础上通过添加增效剂并优化配方,建立了一种快速、简便的提取植物老熟组织及其内部病原总核酸的CTAB-Triton提取法。新的提取液对细胞的裂解能力更强,且解决了传统CTAB溶液因低温析出而致DNA得率损失的弊端。比较了该法和微量葡聚糖柱纯化法制备模板时韧皮部杆菌的检出率,并用该法制备模板,分析了韧皮部杆菌在柚子叶片中的分布情况,及对其它几种柑橘病原菌进行PCR/RT-PCR检测。结果表明,CTAB-Triton方法能有效提取柑橘老熟叶片的DNA,所得DNA质量高,产量比商品化试剂盒大,提高了韧皮部杆菌的检出率,且可用于柑橘其他病原真菌、细菌,以及DNA或RNA病毒病害的PCR/RT-PCR检测,也可用于定量PCR检测和病原种群多态性分析。     

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

2013 年秋季，在山东寿光设施番茄植株上采集到叶片脉间褪绿黄化、叶片边缘卷曲、叶片皱缩，后期叶片变厚、变
脆，并伴随着植株矮化的疑似番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的样本。分别利用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis
virus， ToCV）外壳蛋白基因（CP）序列引物CP-F/CP-R 和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）特异
引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/TY2-F、TY3-R/TY3-F 对其进行检测、扩增，分别得到774 bp（GenBank 登录号KC709510）
和2 781 bp（GenBank 登录号KJ546418）的核苷酸序列。经序列测序后表明，KC709510 与GenBank 已登录的番茄褪绿病毒
ToCV-BJ （KC311375）分离物相似性为99.6%，KJ546418 与GenBank 已登录的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-SDWF-L7（KC999850）
分离物相似性为99.6%。