荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的构建及表达

为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896 bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876 bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3'端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a（+）重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5 ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5 ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。     

荷包猪SLA-1重链四聚体前体链的构建及表达研究

试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1（swine lymphocyte antigen 1,SLA-1）重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a（+）中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列（BirA substrate peptide,BSP）。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a（+）连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876 bp。阳性克隆菌株与pET-21a（+）表达载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4 ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达体系,为下一步进行猪SLA Ⅰ类分子四聚体的检测奠定基础。     

中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达

为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。     

托佩克猪SLA-2基因克隆与表达

为提高托佩克猪SLA-2-TPK基因胞外区在pET-21a的表达量,对其5′端进行密码子优化,并设计表达引物,PCR扩增SLA-2-TPK胞外区,然后克隆入pMD○R19-T Simple Vector,经酶切鉴定后连接至pET-21a载体,转化BL21(Rosseta)进行诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白。PCR结果显示,SLA-2-TPKe大小约为850bp,并成功克隆入pMD○R19-T Simple Vector,双酶切后大小为834bp。酶切后的SLA-2-TPKe成功与pET-21a链接,重组菌经诱导后目的蛋白大小为30.9ku,与密码子优化前重组菌相比,目的蛋白相对表达含量提高约40%。研究证明,密码子优化可明显提高蛋白的表达量,为进行其他蛋白表达研究提供了参考。     

烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体的构建及表达

为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。     

大约克猪SLA-1原核表达载体的构建及表达

为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD^®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD^®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。     

小尾寒羊β_2微球蛋白的表达及其二级结构预测分析

为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ(Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ)轻链四聚体前体链β_2微球蛋白(β_2-microglobulin,β_2m)的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β_2m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β_2m基因,将扩增的绵羊β_2m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β_2m,经双酶切后与表达载体pET-28a(+)连接,再转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中构建pET-28a(+)-OLAⅠ-β_2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β_2m蛋白的二级结构。PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β_2m,插入的目的片段大小为357 bp。阳性克隆菌株与表达载体pET-28a(+)经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后获得pET-28a(+)-OLAⅠ-β_2m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β_2m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β_2m蛋白的二级结构元件α-螺旋(Hh)、β-折叠(Ee)和无规则卷曲(Cc)分别占22.03%、22.03%和55.93%。本研究成功构建了小尾寒羊β_2m基因的pET-28a(+)重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β_2m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础。     

小尾寒羊β2微球蛋白的表达及其二级结构预测分析

为研究小尾寒羊绵羊白细胞抗原Ⅰ（Ovis aries leukocyte antigen classⅠ,OLAⅠ）轻链四聚体前体链β₂微球蛋白（β₂-microglobulin,β₂m）的结构和功能,根据GenBank中公布的绵羊β₂m基因设计特异性引物,提取小尾寒羊全血中的RNA并运用RT-PCR方法扩增绵羊β₂m基因,将扩增的绵羊β₂m基因克隆到pMD18-T载体,筛选出阳性克隆菌pMD18T-OLAⅠ-β₂m,经双酶切后与表达载体pET-28a（+）连接,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中构建pET-28a（+）-OLAⅠ-β₂m重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况;运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β₂m蛋白的二级结构。PCR扩增结果显示,目的基因大小为357 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆到pMD18-T载体,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株pMD18-T-OLAⅠ-β₂m,插入的目的片段大小为357 bp。阳性克隆菌株与表达载体pET-28a（+）经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后获得pET-28a（+）-OLAⅠ-β₂m重组表达菌,经IPTG诱导表达,Western blotting检测目的蛋白大小为17.3 ku,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式表达,经洗涤、变性、纯化、初步获得SDS-PAGE纯化的OLAⅠ-β₂m蛋白;PORTER在线软件预测OLAⅠ-β₂m蛋白的二级结构元件α-螺旋（Hh）、β-折叠（Ee）和无规则卷曲（Cc）分别占22.03%、22.03%和55.93%。本研究成功构建了小尾寒羊β₂m基因的pET-28a（+）重组表达体系,运用SOMPA在线软件预测OLAⅠ-β₂m的二级结构,为下一步绵羊OLAⅠ类分子四聚体的构建奠定基础。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒（NDV）强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA，并引进相应的突变位点，将其克隆到pMD18-T载体，然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序，筛选出阳性重组质粒，并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21（DE3），用1mmol／LIPTG 37℃过夜诱导表达，SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明，所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在，分子质量约28ku，与理论值大小相符。将包涵体用8mol／L脲变性，经Ni-NTA柱纯化，透析复性，得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡（300μg／只），成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

伪狂犬病毒EP0基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

为了研究EP0蛋白在伪狂犬病毒粒子中的定位及其功能,试验利用PCR从伪狂犬病毒基因组中扩增PRV EP0基因的编码区,克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-EP0。经测序鉴定正确后,用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD-EP0,回收EP0基因与经同样双酶切处理的pET-32a(+)进行连接,构建重组质粒pET-EP0。将pET-EP0转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达情况及反应原性。结果表明,成功扩增得到EP0基因编码区序列,大小为1227 bp;重组表达质粒 pET-EP0经诱导后,EP0融合蛋白获得了表达,大小约为75 ku,主要以包涵体形式存在,且能与伪狂犬病毒阳性血清反应。     

3种奶牛乳房炎链球菌的gapC基因原核表达及其免疫原性研究

为研究引起奶牛乳房炎的病原菌停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因工程疫苗及其生物免疫活性,试验采用PCR方法扩增出停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因cDNA序列,克隆到pMD18-T载体上,将重组质粒pMD18-T-TRgapC、pMD18-T-WRgapC和pMD18-T-RFgapC经双酶切鉴定、测序及序列分析后,再将gapC基因亚克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,构建停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌的gapC基因原核表达质粒pET-28-TRgapC、pET-28-WRgapC和pET-28-RFgapC;将构建好的原核表达质粒转化至宿主菌BL21(DH3)中,诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳、纯化、复性后经Western blot检测,得到了约38 ku的条带,与预期大小相符。说明这3种蛋白有一定的免疫原性。     

胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白的原核表达及免疫原性分析

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型SC-A株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜脂蛋白(OML)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pET-32 a(+),成功构建了重组表达载体pET-mOML。以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白(TRX-mOML)分子质量约为60 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,采取非变性电泳方法对蛋白进行纯化,经ELISA检测,重组OML免疫小鼠可产生较高水平的抗OML抗体,这表明重组OML有较好的免疫原性。     

猪戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆与原核表达

为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。     

产气荚膜梭菌B型C58-1株β1毒素基因的克隆表达

利用PCR技术,从B型产气荚膜梭菌中国标准株C58-1株扩增出β1毒素基因,连接pMD18-T 载体筛选阳性克隆,然后用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ对其进行酶切,回收927 bp的β1毒素基因片段,将其定向克隆到载体pET-32a中,获得重组质粒pETβ927。将pETβ927转化至受体菌BL21(DE3)中,其表达产物经His-Trap FF预装柱纯化、SDS-PAGE 检测目的蛋白大小和分布及Western blotting检测其反应原性。结果表明,完整的β1毒素基因大小为1 011 bp,与GenBank发表的B型和C型产气荚膜梭菌β1毒素蛋白序列同源性达99.4%以上;SDS-PAGE结果显示重组目的蛋白在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白大小为 54 ku,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但以包涵体为主。Western blotting检测结果显示表达的重组蛋白可与特异性血清抗体发生免疫反应,表明β1毒素蛋白具有较好的反应原性。     

猪肌肉生长抑制素基因的克隆及原核表达

本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

梅花鹿colX基因的克隆及原核表达

提取健康梅花鹿鹿茸肥大软骨细胞总RNA,以RT-PCR获得colX基因2 038 bp的完整编码序列,将其克隆入载体pMD18-T中,经限制性内切酶和质粒PCR分析,并测序证实的阳性重组子与表达载体pET-28a( )连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。以IPTG诱导,经SDS-PAGE及Western-blot分析表明,获得相对分子质量为65 000的colX蛋白表达带,与预期相符,表明成功获得梅花鹿colX基因蛋白。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与活性检测

参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。     

羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达

应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753 bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白.结果表明,成功构建了pET-28a-Bp-26原核表达载体,并在E.coliBL21中表达Bp-26基因,为开展羊布鲁菌Bp-26目的蛋白的抗原性分析和功能研究奠定了基础.     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...