家蚕孤雌生殖差异脂蛋白30K lipoprotein precursor基因的克隆与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离家蚕孤雌生殖蚁蚕总蛋白,并和正常蚁蚕总蛋白进行比较,得到46个可能与家蚕孤雌生殖相关的差异蛋白点。对这些差异蛋白点进行胶内酶解后基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOFMS)分析,经数据库搜索鉴定,确定其中一个差异蛋白点为脂蛋白30K lipoprotein precursor(30K LPP)。通过5′-RACE技术克隆到30KLPP脂蛋白的全长cDNA序列。生物信息学分析显示该差异蛋白基因全长917bp,编码261个氨基酸,理论分子质量为30.013kD,等电点为7.193;结构域和三级结构预测显示该蛋白包含1个Lipoprotein-11结构域和12个β-折叠。预测其信号肽概率为1.000,定位在1~20aa区域,即可能存在信号肽。细胞定位预测显示该蛋白可能分泌到胞外(SP值为0.934)。分析结果有助于进一步研究30KLPP脂蛋白结构与功能的关系。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

家蚕flightin基因的克隆

Flightin蛋白对于粗肌丝的组装和性能有着重要的作用。为调查家蚕的粗肌丝结构，通过PCR和RACE技术，我们在家蚕中获得了家蚕flightin基因的全长cDNA序列，并通过对家蚕wgs数据库的检索，获得了蚕flightin基因的结构，家蚕flightin执基因由4个外显子和3个内含子组成。家蚕flightin基因的cDNA全长为661bp，编码158个氨基酸残基。家蚕flightin蛋白与黑腹果蝇flightin蛋白的氨基酸同源性为29．67％，但存在保守区域。     

家蚕SoxE基因的全长cDNA克隆和表达谱分析

Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

家蚕单性生殖早期胚胎SSH文库的构建及其序列分析

为了探讨家蚕早期胚胎性别决定的分子机制,以非减数分裂孤雌生殖(AMP)和双精雄核发育(BSA)技术获得的家蚕单一性别早期(2~24 h)发育蚕卵为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了正向和反向抑制消减杂交cDNA文库。在正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机选择62个和46个克隆测序,分别获得43种和29种cDNA序列,其中25个为新的cDNA序列。生物信息学分析显示,抑制消减杂交文库中与单性生殖有关的高温、低温、辐射等诱导表达基因出现的频次较高。对部分文库序列进行半定量RT-PCR分析表明,这些基因在两种单性生殖早期发育胚胎中存在差异表达。     

家蚕追寄蝇孵化酶的基因克隆与特性分析

家蚕追寄蝇寄生于家蚕幼虫引起的蝇蛆病危害蚕业生产。为从分子水平研究家蚕追寄蝇的孵化机制,以发育1.5 d的蝇卵为材料,结合RACE技术获得家蚕追寄蝇孵化酶基因的全长cDNA,命名为EsHE(GenBank登录号：ON042475)。EsHE基因cDNA全长1 507 bp,包含159 bp 5′UTR、412 bp 3′UTR和936 bp的完整ORF,编码311个氨基酸;EsHE蛋白序列含有孵化酶特征序列HELMHVLGFMHE(锌结合基序)和YDYGSVMHY(Met-转角基序);系统进化树分析显示,家蚕追寄蝇与丝光绿蝇的孵化酶亲缘关系最近。qRT-PCR检测EsHE基因在家蚕追寄蝇卵期的表达模式,发现在卵产后36 h EsHE表达量开始大幅上升,至孵化前的48 h达到最高水平;且在3龄幼虫中肠组织高水平表达。这些结果暗示EsHE与家蚕追寄蝇的胚胎发育和孵化密切相关,还可能参与幼虫期的食物消化、蛋白质代谢等生物学过程。通过以家蚕追寄蝇基因组DNA为模板扩增发现,EsHE基因含有1个内含子(2 638 bp)和2个外显子(第1外显子1 005 bp,第2外显子502 bp),基因结构...     

家蚕孤雌生殖差异蛋白——热休克相关蛋白的生物信息学分析

应用双向凝胶电泳(2-DE)技术研究家蚕孤雌生殖蚁蚕和正常蚁蚕的总蛋白质的差异,得到与孤雌生殖相关的差异蛋白点,并对这些蛋白点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析,获得了相关差异蛋白的序列特征。将这些序列与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,得到3个差异蛋白为热休克相关蛋白。通过5-′RACE的方法克隆到3个差异蛋白的全基因序列,并对它们进行结构和特征分析,有助于进一步研究其与孤雌生殖的关系。     

彭泽鲫葡萄糖激酶基因全长cDNA克隆及表达分析

本试验采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆获得了彭泽鲫(Carassius auratus var.Pengze)葡萄糖激酶(GK)基因全长cDNA序列.结果表明,该cDNA全长2 050 bp,含1个1 43l bp的开放阅读框(ORF),编码476个氨基酸,GK蛋白计算分子量为53.78 ku...     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。     

野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara的克隆与选择性剪接

昆虫的钠离子通道蛋白是许多神经毒性药物的作用靶标。根据家蚕钠离子通道蛋白基因(GenBank登录号:EU688970)序列设计引物,分段RT-PCR克隆了野桑蚕钠离子通道蛋白基因Bmmpara(GenBank登录号:EU688972)。序列分析表明,Bmmpara基因的cDNA长5553bp,编码1851个氨基酸,与家蚕基因组序列比对,存在34个外显子,其中第2、22、27外显子存在选择性剪接。根据Bmmpara序列和家蚕基因组序列设计引物,采用PCR方法克隆到3段野桑蚕基因组序列,长度分别为1632、536和3220bp。进一步将Bmmpara编码氨基酸序列与野桑蚕基因组比对,发现有a(ENDLGRTKKKK)、b(GL-KAALCGRCVSS)、c(SLINFVAALCGAGGIQAFKTMRTLRALRPLRAMSRMQGMRV)3个选择性微外元,可能存在6种选择性剪接,构成野桑蚕钠离子通道蛋白不同亚型。     

家蚕经菊酯类农药诱导后脂肪体蛋白的表达谱及烯醇酶基因的组织转录活性

为了从蛋白质水平探讨家蚕对菊酯类农药的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,分析家蚕5龄幼虫经氯氰菊酯诱导前后脂肪体蛋白的表达特征。采用ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到432个蛋白点,诱导实验组检测到369个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有342对,匹配率为76.68%。对特征蛋白进行MALDI-TOF-MS分析鉴定的蛋白包括烯醇酶、线粒体醛脱氢酶、伴侣素、肌动蛋白、gag-like蛋白。烯醇酶(enolase)是糖酵解过程中极为重要的酶类。采用半定量RT-PCR对经氯氰菊酯诱导后的家蚕脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管、血液等7个组织器官的烯醇酶基因进行表达分析,结果表明,烯醇酶基因转录水平在7个组织器官中都呈现下调趋势,分别下调了13.79%、10.71%、22.48%、7.40%、27.00%、11.50%、14.52%,其中脂肪体的烯醇酶基因表达和蛋白的表达下调一致。受菊酯类农药诱导的影响,家蚕5龄幼虫脂肪体蛋白的数目减少,烯醇酶基因在各组织器官减量表达,提示可能与蚕体的基础生理代谢受到抑制有关。     

从云南省地方黄茧品种B黄2克隆的类胡萝卜素结合蛋白基因的cDNA序列分析

类胡萝卜素结合蛋白(CBP)是家蚕黄茧形成的关键因子。利用RT-PCR方法从云南省地方黄茧品种B黄2的5龄幼虫丝腺中克隆了编码CBP的基因cDNA序列。序列及同源性分析表明,克隆的CBP基因cDNA序列全长898bp,编码297个氨基酸残基组成的蛋白,该序列与从日本黄茧品种N4的丝腺中克隆的编码CBP的基因(GenBank登录号:AB062740)序列相似性为100%。生物信息学分析表明该序列编码的CBP蛋白为非分泌型蛋白,且定位于细胞质中的可能性最大。研究结果显示云南黄茧品种B黄2与日本黄茧品种N4的CBP基因CDS序列完全一致,编码蛋白也一样,证明黄茧品种B黄2的茧色不同于N4的茧色,并非是由CBP基因序列产生变异位点导致的,色彩的差异可能是受到黄茧系其它茧色形成因素的影响。     

家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质双向电泳及质谱鉴定

家蚕幼虫头部有单眼、触角、口器、脑等取食和感觉的中心器官及坚硬的外壳。提取家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质进行双向电泳,经银染检测到654个蛋白点,这些蛋白的分子质量主要分布在15～97 kD之间,等电点(pI)在4～8之间;在pH 3～4和9～10的区域,也有较多的蛋白质被检测到,但该区域高丰度的蛋白质数量较少。对丰度较高的100个蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,有52个蛋白质被鉴定,其中有21个酶类相关的蛋白,占被鉴定总蛋白质数的40.4%,其它蛋白质主要包括表皮蛋白、气味结合相关蛋白、肌肉相关蛋白等。研究结果可为家蚕幼虫头部组织的功能分析提供蛋白质水平的信息数据。     

杀虫剂辛硫磷诱导家蚕脂肪体蛋白的表达特征及SerB基因的组织转录活性分析

为了从蛋白质水平探讨家蚕对有机磷杀虫剂的抗性机制,采用双向电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术,分析家蚕5龄中期幼虫在添食杀虫剂辛硫磷前后脂肪体蛋白的表达特征。经ImageMaster6.0软件分析表明,对照组共检测到465个蛋白点,实验组检测到396个蛋白点,其中能匹配的蛋白点有348对,匹配率为73.54%。对特征蛋白进行质谱分析,已鉴定的蛋白包括磷酸丝氨酸转氨酶(SerB)和5'-甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP)。采用半定量RT-PCR分析家蚕5龄幼虫添食辛硫磷后脑、中肠、丝腺、脂肪体、精巢、马氏管等6个组织器官中SerB基因mRNA的转录水平,结果与对照组相比均呈现上调趋势,其中在脑组织的转录水平上调尤为明显,在脂肪体中的转录水平上调与其蛋白的表达上调一致。受辛硫磷诱导的影响,家蚕5龄中期幼虫脂肪体的蛋白数目减少,SerB基因在各组织器官增量表达,推测可能与蚕体对农药的代谢解毒作用有关。     

家蚕化蛹第7天卵巢组织蛋白质标准图谱的构建

家蚕蛹期是卵子发育的重要时期,对蛹期卵巢的蛋白质组学研究将有助于认识家蚕的卵子发育过程。获取处于卵黄生成期的家蚕化蛹第7天卵巢组织,提取蛋白样品进行双向电泳,经银染后检测到682个蛋白点,这些蛋白点主要分布于分子质量15-90 kD、等电点4-8之间。对其中较高丰度的蛋白点进行飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,共分析得到40个可信蛋白点,其中包括4个在家蚕中新鉴定的蛋白。经基因功能分类分析,这些蛋白包括营养储存蛋白、应激相关蛋白、蛋白翻译相关蛋白及代谢相关蛋白等。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

家蚕黄血近等基因系差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕黄血基因(Y)协同作用的相关蛋白的基础信息,通过双向电泳技术对家蚕黄血近等基因系5龄起蚕黄血个体和白血个体的中肠蛋白进行分离并作图像分析,发现分离出的较为清晰的蛋白点主要集中在14～80kD区域,等电点(pI)4～9。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对其中一些差异明显的蛋白点进行鉴定,鉴定结果较为可信的5个蛋白点包括参与能量代谢、蛋白质合成等功能蛋白,这些蛋白可能与家蚕黄血性状的形成有关。采用实时定量PCR方法,对质谱鉴定出的质子转移ATP合酶β亚基2编码基因在家蚕黄血近等基因系黄血个体和白血个体5龄不同发育时期的相对表达量进行分析,结果表明该基因在2种个体中的表达均呈现明显上升的趋势,并且在黄血个体中的表达量明显较白血个体高,5龄第1-2天的相对表达量高7倍左右,提示该基因可能与家蚕的黄血性状有关联。