环形泰勒虫表面抗原重组蛋白Tasp-Tams1-Spag1生物信息学分析与原核表达

运用生物信息学软件对环形泰勒虫表面抗原串联基因Tasp-Tams1-Spag1进行分析,预测其编码蛋白的主要特性与抗原表位等,并对此串联基因进行克隆与原核表达。结果表明:串联重组蛋白Tasp-Tams1-Spag1属于不稳定非分泌型亲水性蛋白;编码346个氨基酸;有4个低复杂性的结构域,且含有Sorb与Btz、NL、NOT的同源区域;可能存在11个B细胞表位优势区段与17个T细胞表位优势区段,含有T、B细胞联合表位,表明Tasp-Tams1-Spag1重组蛋白可能具有良好的免疫原性。IPTG诱导重组蛋白原核表达,结果显示,该重组蛋白以包涵体形式存在;经Western blot检测,表明此串联蛋白反应原性良好,为后续深入研究免疫抗原奠定基础。     

环形泰勒虫表面抗原Tasp-Spag1基因串联表达及其蛋白生物信息学分析

研究环形泰勒虫表面抗原特性,以原核表达系统串联表达其表面抗原Tasp-Spag1,并对其蛋白进行生物信息学分析。通过PCR技术扩增Tasp-Spag1基因片段后构建重组质粒pET-28a-Tasp-Spag1,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE、Western blot检测;运用生物信息学软件对Tasp-Spag1基因片段进行分析,并预测其编码蛋白的主要特性与抗原表位。结果显示,扩增得到Tasp-Spag1基因长度为729bp,原核表达后通过SDS-PAGE与Western blot检测显示,得到大小与预期分子质量相当的目的蛋白;生物信息学分析发现,此串联重组蛋白Tasp-Spag1具有236个氨基酸,属于不稳定的非分泌型、非跨膜亲水蛋白,分别具有33个与21个可能的糖基化与磷酸化位点,有三段低复杂性的结构域,并且含有Sorb、NL的同源区域,可能有10个B细胞表位优势区段与7个T细胞表位优势区段,具有两段交叉反应性表位肽。     

环形泰勒虫TAMS1蛋白的生物学特性分析及多克隆抗体的制备

为了解环形泰勒虫(Ta)TAMS1蛋白(Ta-TAMS1)的生物学特性及其是否具有抗原性,本研究利用PCR技术扩增环形泰勒虫Tams1基因,得到768 bp的Tams1基因目的片段,并将其翻译成相应的蛋白,经各种生物信息学软件分析显示,Ta-TAMS1蛋白理论等电点为8.32,有30个磷酸化位点;二级结构主要由延伸链(33.59%)组成,无规则卷曲占29.69%;具有8个B细胞抗原表位,其疏水平均值为-0.75,为疏水性蛋白。构建原核表达质粒p ET-28a-Tams1并转至大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导获得大小约32 ku的重组融合蛋白Ta-TAMS1;western blot鉴定结果显示,该重组蛋白与环形泰勒虫阳性血清呈阳性反应,反应性较好。将纯化的融合蛋白免疫兔,制备兔多克隆抗体,经间接ELISA方法检测多抗的效价。结果显示获得了Ta-TASM1蛋白多克隆抗体,ELISA检测其效价为1.204 800。该研究为探究Ta-TAMS1蛋白的生物学功能及病原体的血清学快速检测方法奠定基础。     

绵羊肺炎支原体P110/LppT黏附素家族保守区的原核表达和免疫原性分析

绵羊肺炎支原体(Mo) NM2010株的P120蛋白与猪肺炎支原体(Mhp)的黏附素P110高度同源，同属于P110/LppT黏附素N端结构域家族。为了筛选用于研制广谱绵羊支原体肺炎疫苗的保护性抗原，本试验利用生物信息学方法对Mo NM2010株P120蛋白的保守区段、结构、B细胞抗原表位进行预测分析，并对P120基因的N端和C端2个保守区基因片段进行克隆、表达、可溶性分析和抗原特性分析；2个表达产物分别对兔进行免疫试验，用ELISA方法检测免疫兔血清抗体效价和IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子浓度。结果显示，P120蛋白N端有信号肽和1个跨膜螺旋，亚细胞定位在外膜，可能是一种外膜蛋白，P120蛋白N端和C端2个保守区段均有较多B细胞线性抗原表位，具有较好的抗原性；经序列测定证实，合成的P120-N和P120-C 2个基因片段的基因序列完全正确，长度分别为1 509 bp和741 bp,表达的重组蛋白分子质量分别为58.1 kDa和29.5 kDa; P120蛋白N端以可溶和包涵体2种形式存在，C端以包涵体形式存在，均具有良好的抗原性；新西兰大白兔经4次免疫后，重组蛋白...     

Marc145细胞源LSm1基因的巢式PCR扩增及生物信息学分析

为分析LSm1基因的特点,预测其编码蛋白的生物学功能,试验利用巢式PCR方法对Marc145细胞源LSm1基因进行扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学方法对Marc145细胞源LSm1基因进行序列分析,并对其编码蛋白进行二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。结果显示,经过两轮的PCR扩增,成功获得402 bp的Marc145细胞源LSm1基因,编码133个氨基酸。Marc145细胞源LSm1基因核苷酸序列与人类、灵长类同源性较高,其次是海洋哺乳动物类,最后是陆地野生动物及家畜,同源性为92.8%~99.8%,而其编码的氨基酸虽没有此规律,但氨基酸序列同源性均较高,为97.8%~99.3%。系统进化树结果显示,Marc145细胞源LSm1基因与人类LSm1基因亲缘关系较近,处在同一分支,其次是灵长类。LSm1蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,分别为45.11%和24.06%。预测此蛋白存在4个B细胞优势抗原表位,具有Sm超家族保守结构域,无跨膜区域,无信号肽区域。结果表明,LSm1蛋白在细胞内转录及表达水平可能较低,细胞cDNA需通过巢式PCR扩增两轮才能出现目的条带,本试验方法为LSm1基因的扩增提供了参考。同时,LSm1生物学功能预测结果为获得LSm1人工表达蛋白与针对LSm1蛋白的特异性抗体制备,以及在细胞水平研究LSm1的功能机制及其在病毒复制中的作用奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白抗原表位的串联表达及间接ELISA方法的建立

本研究旨在建立一种快速、简便的鸡传染性支气管炎抗体的检测方法.通过生物信息学软件对传染性支气管炎病毒(IBV) ZY3株的S1蛋白进行分析后,筛选出4段S1蛋白抗原表位优势区域(FI～F4),将4段表位串联成1条新基因F,对F基因编码的蛋白质进行二级结构预测·结果表明该蛋白抗原指数性高且具有良好的柔韧性.构建重组表达载体pET-32a(+)-F,并在原核表达系统中表达,获得大小为42 ku的融合蛋白,经Western blot 分析表明表达的串联蛋白具有良好的反应原性.以纯化的串联蛋白作为包被抗原,建立了一种检测IBV抗体的间接ELISA方法.利用建立的ELISA方法对采集来175份血清样品进行检测,并与商品化试剂盒进行对比,显示其阳性符合率为90.2％,阴性符合率为85.7％,总体符合率为89.7％o,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性.     

猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)S1基因(1—1 566bp),体外表达S1基因抗原表位预测区Sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析S1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将S1基因抗原表位预测区Sa克隆至原核表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b-Sa,转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达、超滤柱浓缩纯化重组蛋白、Ni柱亲和层析,Western blot检测Sa蛋白的活性,将Sa蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果表明,CHN-2015毒株S1基因开放型阅读框大小为1 566bp(GenBank No.KY398009),编码522个氨基酸,是具有亲水性的非跨膜蛋白,存在15个潜在的B细胞抗原表位;原核表达Sa重组蛋白,该蛋白质在37℃下用终浓度为0.8mmol·L~(-1)IPTG诱导5h后,蛋白质主要以可溶性形式存在,免疫印迹显示表达的Sa蛋白在上清与包涵体中都有良好的反应性;用纯化的Sa蛋白四次免疫家兔,获得的兔抗Sa蛋白抗体效价可达1∶10 240。本研究克隆了S1基因,原核表达了Sa蛋白和制备了高效价的兔抗Sa蛋白抗体,具有良好的免疫原性,为后续深入开展S蛋白的功能研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础.     

鸡传染性支气管炎病毒多表位核酸疫苗的构建和表达

通过文献报道和计算机软件分析筛选出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)结构蛋白基因S1、S2、N基因的T、B细胞的优势抗原表位共7段,采用人工合成及PCR方法将各抗原表位以柔性氨基酸(GP/GA)作为接头串联成一条全新的多表位嵌合基因F,并定向克隆入真核表达质粒pVAX1,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒.阳性质粒pVAX-F通过脂质体转染COS-7细胞进行表达研究.提取转染细胞总RNA,RT-PCR方法检测到目的基因的转录;间接免疫荧光试验(IFA)检测到特异性荧光存在.表明表达产物能与相应抗体特异性结合,证明了具有一定的生物学活性和抗原性,有望成为抗IBV的核酸疫苗.     

山羊瘤胃中单宁降解菌的分离、筛选和鉴定

本试验旨在从山羊瘤胃中分离、筛选和鉴定单宁降解菌。从隆林山羊瘤胃采集内容物,采用单宁浓度耐受培养基进行初筛,再采用单宁酶活力鉴定培养基分离、筛选单宁降解菌,筛选出的细菌通过16S r DNA基因序列测定初步鉴定,将菌株在单宁浓度为0.5%、1%、1.5%的单宁酶诱导培养基中培养,测定酶活力。结果表明:共分离、筛选到4株降解单宁的细菌,根据16S r DNA基因序列分析结果,分别为产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、克斯特菌(Kerstersia)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。经单宁酶诱导培养基培养后,Kerstersia的胞内单宁酶活力高于其他3株菌,而其他3株菌的酶活力较为接近;Kerstersia、Providencia vermicola和Pseudomonas aeruginosa经1%单宁浓度诱导的单宁酶活力均高于经0.5%和1.5%单宁浓度诱导(P0.05)。本试验成功从山羊瘤胃中筛选、分离、鉴定出4株单宁降解菌,且它们均表现出较高的单宁酶活力。     

中国草地自然灾害及其防治对策

介绍了中国草地的五大自然灾害,提出了综合防治的五项对策。     

An equine herpesvirus 1 (EHV-1) vectored H1 vaccine protects against challenge with swine-origin influenza virus H1N1

In 2009, a novel swine-origin H1N1 influenza A virus (S-OIV), antigenically and genetically divergent from seasonal H1N1, caused a flu pandemic in humans. Development of an effective vaccine to limit transmission of S-OIV in animal reservoir hosts and from reservoir hosts to humans and animals is necessary. In the present study, we constructed and evaluated a vectored vaccine expressing the H1 hemagglutinin of a recent S-OIV isolate using equine herpesvirus 1 (EHV-1) as the delivery vehicle. Expression of the recombinant protein was demonstrated by immunofluorescence and western blotting and the in vitro growth properties of the modified live vector were found to be comparable to those of the parental virus. The EHV-1-H1 vaccine induced an influenza virus-specific antibody response when inoculated into mice by both the intranasal and subcutaneous routes. Upon challenge infection, protection of vaccinated mice could be demonstrated by reduction of clinical signs and faster virus clearance. Our study shows that an EHV-1-based influenza H1N1 vaccine may be a promising alternative for protection against S-OIV infection.     

A/H1N1研究进展

2009年3以来,包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了甲型H1N1流感[Swine-origin Influenza A (A/H1N1)]疫情,WHO已于2009年6月20日将此次流感流行的预警级别提升至6级.现已基本明确,引起此次流感疫情的A/H1N1流感病毒是猪流感病毒(Swine Influenza Virus, SIV)的一种新型变异株.此次流感疫情的发生,再次使猪流感成为社会各界关注的焦点之一.本文就甲型H1N1流感的临床表现、病毒特征、相互关系及其对动物卫生监督工作的影响等作一综述.     

鸽禽I型副粘病毒油佐剂灭活苗对肉种鸽免疫效果观察

用鸽Ａ／ＰＭＶ－１ＳＸ株（简称ＳＸ株）制成的油佐剂灭活苗与ＮＤＶ油佐剂灭活苗分别免疫肉种鸽,免疫后２０天抗体水平达到峰值,抗体水平在３ｌｏｇ２以上维持３０天以上。免疫后４０天用鸽ＳＸ株和新城疫强毒对两种疫苗免疫鸽分别进行攻击,两种疫苗免疫组对ＮＤＶ强毒攻击的保护率均为１００％,鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率为１００％,而ＮＤＶ油佐剂灭活苗免疫组对鸽ＳＸ株攻击的保护率仅为６６７％。鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗田间试验抽检４８份肉种鸽血清,抗体平均值为４３０±１１６ｌｏｇ２。