枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

SRAP分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用

以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物组合对西班牙枇杷品种Javierin进行了SRAP分析体系的优化,结果表明,在25μL反应体系中,5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:dNTPs0.3mmol/L,Mg2+2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng,优化的扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min30s,5个循环;之后94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min30s,35个循环;最后72℃下延伸10min。并将该优化的体系在来自中国、西班牙、日本、意大利和美国的46份枇杷种质资源上进行了SRAP扩增的初步应用,经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳均获得了清晰、重复性好的SRAP指纹图谱。     

正交设计对‘红阳’猕猴桃ISSR反应体系的优化研究

以‘红阳’猕猴桃及其杂交F1代为试材,通过正交设计对ISSR-PCR扩增反应的影响因子进行优化,初步确立了适合‘红阳’猕猴桃ISSR-PCR反应体系:总体积20μL,10×PCR buffer2.0μL,Mg2+0.75 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 60 ng,引物1.25μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L。扩增程序:94℃预变性7 min,94℃变性30 s,50~58℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环,72℃延伸7 min。引物UBC841的最佳退火温度为58.5℃。应用该优化反应体系,用UBC835对35份杂交F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化后的反应体系具有较高的稳定性。     

梨SCoT-PCR反应体系的优化及‘库尔勒香梨’营养系变异鉴定

【目的】建立稳定性好、可重复性强、多态性扩增效果好的‘库尔勒香梨’SCoT-PCR反应体系,证明SCoT分子标记可以用于梨属植物优良营养系的鉴定。【方法】以新疆库尔勒农二师29团、33团和34团的‘库尔勒香梨’优良营养系为试材,通过L25(56)正交试验设计对‘库尔勒香梨’SCoT-PCR反应体系进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和正交设计助手Ⅱ软件对正交设计扩增结果进行分析,从筛选出的20个引物中随机选择2条引物对24份材料扩增,用DNAMAN、Editseq、ORF Finder和NCBI-BLAST-tblastx对测序结果分析。【结果】优化后的香梨SCoT-PCR 20μL反应分析体系含(2.5 mmol·L~(-1)10×buffer with Mg~(2+))2.5μL、Taq酶1.5 U、引物10μmol·L~(-1)、模板DNA25 ng、dNTPs 1.6 mmol·L~(-1)。反应程序为94℃预变性4 min;94℃变性1 min,52℃退火45 s,72℃延伸1 min,30次循环;72℃延伸8 min。对测序结果分析表明:扩增产物的大小为200~2 000 bp,23份材料与对照材料存在单碱基的缺失,利用单碱基变异可以区分出24份材料,说明18份优良营养系材料发生了遗传变异。【结论】SCoT分子标记可用于梨树营养系变异的鉴定。     

苹果IRAP技术体系的建立及优化

通过苹果逆转座子长末端重复序列(LTR)保守区域设计引物,对影响苹果IRAP反应的重要因素进行了研究,建立并优化了苹果IRAP分子标记技术体系。优化的苹果IRAP分子标记体系为:25μL反应体系中,模板DNA50ng、Mg2+2.5mmol·L-1、dNTPs0.2mmol·L-1、10×buffer2.5mmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0U、引物0.4μmol·L-1。该体系在所试苹果品种中均获得了较理想的扩增效果,并能鉴定部分芽变品种。     

正交设计优化果梅ISSR反应体系

以果梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)品种鸳鸯梅为试材,采用改良的CTAB法提取果梅嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)探讨Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对果梅ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了果梅的ISSR-PCR优化反应体系,在20μL反应体系中含2μL10×Buffer,2.5mmol·L-1Mg2+,0.2mmol·L-1dNTPs,0.32μmol·L-1引物,20~80ng模板DNA,0.75UTaqDNA聚合酶。在此基础上探讨了引物UBC840的最适退火温度、最佳循环次数及延伸时间,引物UBC840的最适退火温度为50.6℃。应用该优化反应体系,用2个不同引物对19份果梅资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的稳定性。     

锥栗自然居群ISSR-PCR分析技术的建立

提取野生锥栗的基因组DNA作为ISSR-PCR模板,对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶用量5个主要影响因素进行梯度试验,并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨,初步确立了适合野生锥栗的ISSR-PCR分析技术体系,即25μL反应体系中,模板DNA40或50ng、Mg2+2.25mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.2μmol.L-1、TaqDNA聚合酶1.0U;PCR扩增程序为:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,(Tm+2～4℃)退火45s,72℃延伸2min,共32个循环;最后72℃充分延伸5min;1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。     

安徽乌菜SRAP技术体系的优化

以合肥黄心乌为试材,利用正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度和模板DNA浓度进行5因素4水平的筛选分析,用me3-em3引物组合进行PCR扩增以确定最佳反应体系。结果表明,安徽乌菜SRAP-PCR最佳反应体系为:10×PCR buffer 1μL,Mg2+ 3.0mmol·L-1,dNTPs 0.2mmol·L-1,引物各0.5mol·L-1,模板DNA 4.0ng·μL-1,Taq聚合酶0.05U·μL-1,总体积为10μL。利用此反应体系对安徽乌菜进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,可用于安徽乌菜的遗传分析。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化

SCoT标记是一种新型目的基因分子标记方法,采用L16(45)正交试验和单因素试验2种方法优化了葡萄SCoT-PCR反应体系,结果表明正交试验中关键影响因子为dNTPs浓度,单因素试验中为dNTPs和Mg2+浓度.综合2种方法,优化的葡萄SCoT-PCR反应体系为:Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 ...     

樱桃SRAP-PCR体系优化及其遗传多样性分析

选取亲缘关系较远的3个不同基因型樱桃资源为试材,对影响SRAP标记PCR反应的模板、Mg2+、dNTPs、Taq酶及引物浓度进行了优化,建立了适合于樱桃SRAP标记的扩增体系。反应体系具体为:模板DNA75ng,dNTPs0.2mmol·L-1,Mg2+2.5mmol·L-1,引物0.3μmol·L-1,Taq酶1.0U,反应总体积20μL。采用优化的扩增体系,对45个樱桃种质材料进行了遗传多样性分析,筛选8对扩增清晰且多态性高的引物组合,检测位点共227个,其中多态性位点192个,占84.6%。应用NTSYS-pc软件进行聚类分析(UPGMA),结果表明45个樱桃品种可分为欧洲甜樱桃和中国樱桃2大类,品种间遗传相似系数在0.52～0.98;其中中国樱桃与甜樱桃种间的相似系数最小,表明2类种质具有不同的遗传背景;而组群内的不同品种资源表现了较高的遗传相似性。SRAP分子标记的聚类分析揭示了樱桃品种间亲缘关系与地理分布以及来源相关。     

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素（模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶）在4个水平上进行正交优化试验。结果表明：各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为：引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+。建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为：模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol?L-1、Mg2+浓度2.0 mmol?L-1、dNTPs浓度0.125 mmol?L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U。     

桦褐孔菌ISSR-PCR反应体系优化与建立

采用改良CTAB法提取了桦褐孔菌总DNA,确定ISSR最适25 μL反应体系为模板DNA浓度15 ng·μL-1,dNTPs 浓度150 μmol· L-1,引物浓度25 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶浓度2.0 U,Mg2+浓度1.4 mmol· L-1,10×buffer 2.5 μL,其余用ddH2O补足;确定ISSR扩增程序为:94℃预变性5 min,35个循环:94℃变性1 min、45℃～51℃退火1 min(退火温度因不同引物而定)、72℃延伸1 min,最后72℃延伸5 min,4℃保存.筛选出16条ISSR引物,并成功应用引物UBC842完成了21株桦褐孔菌的ISSR-PCR反应.     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。