羽脉山黄麻丛枝植原体的分子鉴定及病害调查

【目的】了解羽脉山黄麻丛枝病在云南省玉溪市新平县的发生情况和危害程度,通过分子生物学方法确定病原物及其分类地位,为本地区植原体防控提供参考。【方法】利用普查法获得病害发病率,评估病害危害程度。利用植原体通用引物P1/P7及R16F2n/R16R2对感病植株总DNA进行巢式PCR扩增、克隆和测序,得到16S r DNA序列。再用植原体在线分类鉴定工具i PhyClassifier以及MegaX软件分别进行序列分析和构建基于16S r DNA序列的系统进化树,确定病害病原物及其分类地位,通过在线分析软件MUSCLE比较相关序列的同源性。【结果】根据调查发现羽脉山黄麻丛枝病发生于大约101°35'—101°53'E和23°56'—24°20'N之间,主要是在低海拔400～600 m温度相对较高的干热河谷地区,说明高温有利于植原体病害的发生。该处连续3年发生此病害,2018年7月调查得知其平均发病率为38.9%,属中度危害。PCR扩增获得约1 246 bp的羽脉山黄麻丛枝病植原体16S r DNA序列(株系:TLWBYN01,登录号:MN513329)。分析表明TLWBYN01与翠菊黄化植原体(Candidatus Phytoplasma asteris)的参考菌株(M30790)相似度为99.8%,因此该植原体为‘Candidatus Phytoplasma asteris’相关菌株,属于16S r I组成员。TLWBYN01的F2nR2片段虚拟RFLP模型与16S r I-X亚组的参考模型番木瓜束顶植原体(登录号:JF781308)最为相似,相似系数为0.98,17种限制性内切酶的酶切图谱显示与16S r I-X参考株只有MseI不同,因此该植原体属于16S r I-X亚组的变种。比较得出TLWBYN01与16S r I-X亚组成员番木瓜束顶植原体(JF781308)和印度葫芦植原体(LT594117、LT594118)同源性分别为99.2%和99.6%。【结论】玉溪市新平县发现的羽脉山黄麻丛枝病属局部常发病害,中度危害,但一旦感染,就会严重影响植物生长。羽脉山黄麻丛枝植原体属16 Sr I组成员,也是报道较少的植原体16S r I-X亚组的一个变种,且羽脉山黄麻为新发现的植原体新寄主。     

早竹丛枝病的调查及病原菌的分子鉴定

[目的]对早竹丛枝病进行调查及病原菌分子鉴定,为早竹丛枝病的病害诊断和防治提供科学依据。[方法]采用单株水平和单枝盘水平的2种病害分级标准对早竹丛枝病进行调查。使用植原体16S rDNA和真菌rDNA-ITS序列的特异性PCR引物,对早竹丛枝病的病原菌进行分子鉴定。[结果]调查的6块样地早竹丛枝病的平均发病率为18.59%,平均病情指数为6.67。感病的早竹DNA样品能够扩增出真菌的rDNA-ITS序列,而不能够扩增出植原体的16S rDNA序列;扩增出的序列与报道的竹针孢座囊菌的序列同源性达到99.00%,与其它真菌的序列同源性最高仅为94.00%。[结论]浙江省德清县早竹丛枝病的病原菌为竹针孢座囊菌。     

灰叶丛枝病病原的分子鉴定及系统发育分析

实验应用PCR扩增、iPhyClassifer分析、序列同源性及系统发育分析等方法对海南省灰叶丛枝病病害进行了分子检测及其病原的鉴定、系统进化研究.iPhyClassifer结果显示:灰叶丛枝病植原体为花生丛枝组(16SrⅡ组)16SrⅡ-A成员.序列同源性分析结果表明:灰叶丛枝病植原体与16SrⅡ、16SrⅡ-A成员...     

多位点序列分析揭示我国16SrI组植原体不同株系间遗传变异和系统发育关系（英文）

【目的】16SrI组植原体对我国作物和生态植物危害严重。目前植原体尚不能分离培养,对于我国植原体不同株系间遗传变异和种群结构尚不清晰,通过多位点序列分析(MLSA)揭示我国不同地区16SrI组不同植原体株系的遗传多样性及其地理分布特征,比较不同植原体株系间不同持家基因的变异程度,为我国不同植原体株系的检测、分类鉴定和系统发育研究提供一定的参考方法和依据。【方法】应用rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析我国10个省(市)苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系(共18株)的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。【结果】我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,从而揭示16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰地分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系系统发育关系最近,多位点序列分析可将这2种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系清晰地区分。10株苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。【结论】多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。     

4种植物病害植原体病原质粒全序列测定及分子特征

根据已发表植原体质粒序列设计引物,经2次PCR扩增,获得大小不同的2段DNA片段,测序后拼接得到4种完整的环状质粒,分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒(pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒(pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒(pCWBFq-2),其中pMDPy为首次测定,其质粒全长分别为3 833,3 943,3 843和3 913 bp,4种质粒皆编码5种蛋白,ORF1和ORF5分别编码复制相关蛋白(RepA)和单链DNA结合蛋白(SSB),ORF2-4编码未知功能蛋白.4种质粒序列的非编码区分析表明,ORF1和ORF2之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点.将4种植原体质粒全序列与GenBank中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析,结果表明这4种质粒与其他16Sr Ⅰ组的质粒聚为一个大的分支,与16S rDNA系统发育树基本一致.这可为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性和质粒基因变异及进化奠定基础,也可为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据.     

泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因多态性分析

设计引物并 PCR扩增河北平山株系 PaWBPs 和江西吉安株系 PaWBJan 的 tmk 基因,直接和克隆测定tmk序列,利用DNAMAN,MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明：从 PaWBPs和 PaWBJan中克隆测序的93条和41条 tmk-a中,分别有52和24种不同的序列,tmk-a ORF 可被划分为2类,tmk-a-1为639 bp,tmk-a-2为627 bp,PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5,而PaWBJan株系为3.3; PaWBPs有5个相同的 tmk-a-1序列与 PaWBJan的一个 tmk-a-1序列及枣疯植原体 tmk-Y 序列完全一致。因多位点突变,PaWBPs含假基因比例达48.1%,PaWBJan的为41.7%; tmk-b基因为单一序列,两株系的 tmk-b核酸序列相似性为99.8%,编码蛋白仅有一个氨基酸差异。TMK-a和 TMK-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示,泡桐丛枝植原体的2个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝Ⅰ中;而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝Ⅲ,基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致,tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类,而 tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。     

枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究

分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸3个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗(Ft)和扁核酸组培苗(HPD)在未加任何激素的MS培养基和其它培养基交替继代培养1a以上仍能维持丛枝苗生长;而发病梨枣(LD)除产生丛枝外,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养,并已在实验室内连续保藏达10a,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树Ft染病材料作接穗,以健康冬枣(DJ)和抗病婆枣(W14)砧木进行组培苗间嫁接传病试验,可使部分DJ和W14发病;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山东泡桐丛枝病植原体ZD株系丛枝组培苗为接穗,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系MB33、TY2T和C125发病。用植原体16SrDNA通用引物进行PCR,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用DAPI荧光显微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度,结果显示,Ft和嫁接发病冬枣(DJ-Ft)筛管中植原体浓度相对较高,但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗;HPD和LD浓度中等,而发病的W14砧木含有植原体的筛管数量较少、且浓度很低。在嫁接不成功或未发病的DJ和W14砧木组织及健康对照组织中皆检测不到植原体荧光。     

绣线菊丛枝病病原的分子鉴定

用植原体16S rRNA基因的通用引物,对表现黄化、丛枝、顶枯等症状的绣线菊DNA进行PCR扩增,得到了约1.2kb的特异性片段.测序结果证明其病原为植原体.RFLP和序列分析表明:该分离物属于翠菊黄化组的16SrⅠ -B亚组.与GenBank中其他植原体分离物序列比较,发现该分离物与16SrⅠ -B亚组中的西方翠菊黄化植原体(SAY)同源性高达99.6%.     

植原体分子分类的现状与问题

从 2 0世纪 80年代末开始 ,植原体的DNA分子分类研究取得了实质性进展 ,植原体的系统学位置被确定为柔膜菌纲的一个单系发育类群 ,作为一个暂定属 (Candidatusgenus)处理。利用 16SrDNA、16S 2 3S间隔区、rp、Tuf等一系列基因序列及其RFLP图谱 ,对全世界近 30 0种植原体进行了分子分类。按照李英敏和Seemuller的分类系统 ,植原体分别被划分为 14个 16SrDNA类群和 2 0个 16SrDNA类群。根据ICSB的规定 ,每一个 16SrDNA类群作为一个暂定种 (Candidatusspecies)。每个 16SrDNA类群内有较大的遗传分化 ,可分为很多亚组。目前全世界共发表了 5个植原体暂定种 ,分别为“CandidatusPhytoplasmaaurantifolia” ,“CandidatusP .aus traliense” ,“CandidatusP .australasia” ,“CandidatusP .fraxini”和“CandidatusP .japonicum”。其中的 4个种是16SrDNA类群的亚组。植原体暂定种的概念还存在一些理论和实践上的问题。文中列出了李英敏的分类框架 ,并讨论了植原体分子分类的发展方向     

泡桐丛枝病发生与代谢组变化的关系（英文）

【目的】通过对泡桐健康苗和丛枝病苗进行代谢组分析,探讨代谢物变化与泡桐丛枝病发生的关系。【方法】利用非靶标的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对长度为1.5 cm的健康和植原体感染的毛泡桐组培苗顶芽进行代谢组分析,将上机检测得到的质谱数据用主成分分析和偏最小二乘判别分析法进行分析得到最终差异的荷质比,并将其比对到KEGG代谢物数据库中,通过分析找到植原体感染的毛泡桐组培苗与健康组培苗之间代谢物含量和种类的差异。【结果】毛泡桐病苗和健康苗中有1 612种代谢物发生变化。与健康苗相比,在病苗中有765种代谢物含量下降,847种代谢物含量增多。KEGG代谢通路分析表明,这些代谢物中有460种代谢物参与111个代谢途径,其中变化显著的3个代谢途径为"异喹啉生物碱合成"、"双萜类生物合成"和"黄酮生物合成"。另外,病苗中参与植物激素信号转导的代谢物也发生明显变化。其中在植原体感染的毛泡桐病苗中玉米素、玉米素核苷、赤霉素、二氢玉米素核苷、花葵素、黄芩素和花青色素等含量发生明显变化,表明这些代谢物含量的变化可能与丛枝病发生有一定关系。【结论】通过比较健康苗和病苗中代谢物含量和种类的变化,找出可能与丛枝病发生密切相关的代谢物及其相应的代谢通路,该结果有助于进一步阐明泡桐和其他植物丛枝病发生分子机制,并为泡桐丛枝病有效防治奠定基础。     

寡核苷酸管芯片技术检测和鉴别我国不同组植原体

[目的]不同组植原体检测和鉴别的特异性探针已有报道,为了筛选出适合于我国不同组植原体检测和鉴别的特异性探针,建立管芯片检测和鉴别植原体技术,并对我国发生的疑似植原体病害进行鉴别。[方法]通过PCR扩增结合管芯片杂交技术,对收集到的15种植原体侵染的植物样品及其健康对照进行检测和鉴别。[结果]建立了管芯片检测和鉴别植原体技术体系。15种病害样品中,13种获得显著的阳性杂交信号,并且所有的健康对照都呈现为阴性。13种植原体病害依16Sr DNA直接测序可分为16SrⅠ、Ⅱ、Ⅴ、XIX四组植原体。在所有探针中,植原体的通用探针(Pp-502)可以检测到所有确定的植原体样品。16SrⅠ组特异性探针(PpⅠ-465)可以确定16SrⅠ组的泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩和莴苣黄化4种植原体样品。16Sr II组特异性探针(PpⅡ-629)仅可以确定16Sr II组的花生丛枝、甘薯丛枝和臭矢菜丛枝3种植原体样品。但16Sr V组的枣疯病、樱桃致死黄化和重阳木丛枝及16Sr XIX组的板栗黄化皱缩植原体与其他组专化性探针皆有明显的交叉杂交信号。相比于PCR扩增的凝胶电泳检测,管芯片检测的灵敏度提高了1 000倍。对疑似植原体病害的诊断结果显示河南濮阳的红花槐丛枝的病原应为16Sr V组植原体,福建福州的长春花黄化丛枝应为16SrⅠ组植原体;而北京戒台寺牡丹黄化皱叶和内蒙古包头柳树丛枝未出现任何植原体专化的杂交信号。[结论]管芯片杂交技术作为一种检测和鉴别植原体的方法,可应用于我国植原体病害调查和诊断,并为植原体的鉴别和分类提供可靠的依据。     

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。     

葡萄酒乳酸菌分子鉴定研究进展

该文介绍了16S rDNA/rRNA序列分析、16S-23S rRNA基因间隔区（Intergenic Spacer Region,ISR）序列分析及基于 PCR技术的ARDRA、RAPD、AFLP、RFLP等分子标记技术的方法和原理,并对它们在葡萄酒乳酸菌分子鉴定中的应用进展进行综述。     

注射传播泡桐丛枝病类菌原体的初步研究

以泡桐丛枝病类菌原体的敏感指示植物长春花苗为材料,用叶柄注射法注入感病泡桐叶汁液进行接种试验,结果表明,有1/4供试植株感病,其症状与泡桐丛枝病相一致,将感病植株叶脉切片镜检,发现有类菌原体,其形态、大小及结构,均与泡桐丛枝病类菌原体相同。为该病病原的传播及回接提供了一条简便的途径。     

泡桐丛枝病类菌原体(MLO)的抽提及其抗血清的制备

<正> 泡桐丛枝病是我国重要的林木病害。病原可通过嫁接传染和昆虫介体传染,将泡桐丛枝病病枝作超薄切片,电镜观察,发现病株的新梢和叶柄的皮部组织中存在大量的类菌原体。但是泡桐丛枝病与其它植物类菌原体病一样,病原物至今未能分离培养成功,病原的研究尚在电镜研究阶段。为了进一步研究泡桐丛枝病病原类菌原体的性质,我们采用抽提的方法获得数量较多,纯度较好的泡桐丛枝病的病原类菌原体,并用病原抽提物制备成功泡桐丛枝病的抗血清。     

一株茶树叶部内生木霉的分离和鉴定

以健康茶树为材料,采用组织分离法分离获得1株内生真菌CSN-16。该真菌的孢子形状、菌丝形态、菌落生长速度等形态学特征与木霉的特征基本一致;进一步进行分子鉴定,获得该菌株的18S rDNA部分序列,并提交Genebank,获得基因登录号为EU678669。18S rDNA序列系统进化分析显示该菌株与拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)的同源性最高,相似性达99%。初步鉴定该菌株为拟康氏木霉。     

泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

胸苷酸激酶是d TTP从头合成和补救途径的关键酶,催化d TMP形成d TDP,在DNA复制和生物的生存中发挥着必不可少的作用。本文在前期研究的基础上,对从泡桐丛枝(Pa WB)植原体中获得的的3个同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮(WBD)、洋葱黄化(OY-W)植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析,结果显示Pa WBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%;Pa WBPS TMK-a-1与Pa WBPS TMK-a-2的相似性为90.57%,且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%;而Pa WBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的p ET28a原核表达载体,对Pa WBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2 3种蛋白进行了原核表达,经Ni-NTA柱纯化后,利用双酶法进行了胸苷酸激酶催化活性测定,结果表明,Pa WBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性,为85.96±0.74 U·mg-1,而Pa WBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。本文为进一步研究胸苷酸激酶在植原体繁殖过程中的作用机理奠定了基础。     

冷库中低温细菌的分离及鉴定

从来自冷库中的样品中共筛选分离出5株低温细菌。对分离的低温细菌进行了分类鉴定,主要进行了生理、生化特性分析,对其中的2株细菌作了16S rDNA测序并通过BLAST比对进行了鉴定。生化鉴定结果表明：所有分离到的低温细菌均为革兰氏阴性菌。经16S rDNA鉴定的3株低温细菌全部为假单孢菌属的菌株。     

桉树人工林“滞长症”植原体探讨

2005年以来,在广东、广西地区出现了大面积桉树商品人工林无性系生长停滞的现象,为了确定该病症是否由植原体侵染引起,用直接PCR和巢式PCR扩增植原体16SrDNA的方法对具有典型症状的样品进行了植原体检测,结果并没有检测到植原体的存在。     

五种树木丛枝病的病原体观察

<正> 树木丛枝病是一类常见的病害,最早认为由生理障碍引起,后又认为是病毒或真菌浸染所致。自1967年发现类菌原体(MLO)致病以来,一些具有黄化、丛枝症状的树木病害陆续被证实是由类菌原体(MLO)或类细菌(BLO)引起。笔者近年来对引起树木丛枝病的类菌原体病害进行了调查和电镜观察,报道了由MLO引起的泡桐丛枝病和重阳木丛枝病,由类立克次体(RLO)引起的枫杨丛枝病及由BLO 和