红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成。采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS（GenBank登录号：DQ364604）。该基因编码区长为1182bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子。该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点。     

红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成.采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS(Gen-Bank登录号:DQ 364604).该基因编码区长为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位.对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子.该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点.     

篦子三尖杉牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆与序列分析

三尖杉是我国特有植物,主要含有生物碱、黄酮及萜类等生物活性物质。以篦子三尖杉为试验材料,根据同源克隆的方法扩增三尖杉牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPPS)基因,并通过生物信息的方法对该基因进行鉴定和分析。结果表明,篦子三尖杉GGPPS基因全长1 217 bp,含有1个完整的1 182 bp开放阅读框(ORF),编码393个氨基酸的蛋白序列,GGPPS蛋白相对分子量为43.042 ku,理论等电点(p I)为6.57,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成;蛋白质同源分析表明,三尖杉GGPPS含有多聚异戊二烯基合成酶家族中保守的5个特征性结构和2个富含天冬氨酸的区域;同源模建分析显示,三尖杉GGPPS具有GGPPS蛋白典型的三维结构,特别与薄荷GGPPS蛋白的三维结构及活性位点极其相似;系统进化分析表明,三尖杉GGPPS蛋白归属植物进化支,且与加拿大红豆杉、曼地亚红豆杉、海南粗榧的GGPPS蛋白归为同一分支。     

马尾松GGPPS基因cDNA序列克隆及正义、反义植物表达载体的构建

以马尾松幼苗针叶组织为材料,依据Genbank中已报道的GGPPS基因CDS区序列设计特异引物,经RT-PCR技术克隆得到GGPPS基因cDNA序列。克隆片段经酶解后分别正向、反向插入植物表达载体p-GFP,构建成GGPPS基因正义、反义植物表达载体。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,建立植物表达载体系统,为下一步植物转化研究过表达、抑制表达GGPPS基因对萜烯类物质合成的影响建立研究基础。     

百合萜烯合成相关基因LiGGPPS大小亚基基因的克隆、表达及功能分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）是调节萜类化合物生物合成的关键酶，为了研究GGPPS基因在百合萜类物质合成中的作用，本试验以‘西伯利亚’百合（Lilium ‘Siberia’）为试材，克隆了GGPPS大亚基（LiGGPPS.LSU）和小亚基（LiGGPPS.SSU）基因，并分析其表达和功能。通过生物信息学分析、相对表达量分析、荧光定量PCR、亚细胞定位、基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）预测并验证其特征及功能，揭示其表达模式。结果表明，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分别为1 100 bp和1 040 bp，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU的氨基酸序列与其他物种的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU的氨基酸序列具有较高的一致性，系统进化树显示它们分别与薯蓣（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳拟兰（Apostasia shenzhenica）亲缘关系最近。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因均定位在叶绿体中，表达量随百合的生长发育呈现先上升后下降的趋势。LiGGPPS.LSU在花被片中高量表达，LiGGPPS.SSU在花药中显著高量表达。VIGS试验显示芳樟醇、罗勒烯、月桂烯释放量下降。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因对百合花香单萜类物质合成具有重要作用，本试验为进一步研究百合GGPPS以及相关代谢途径提供理论基础。     

15种药用植物的GGPPS蛋白生物信息学分析

利用生物信息学的方法对15种药用植物GGPPS蛋白的理化性质、亚细胞定位、功能结构域、二级结构以及三级结构等方面进行预测和分析。结果表明,药用植物GGPPS蛋白是一种亲水性、不稳定的非跨膜蛋白,都具有一个相同的功能结构域polyprenyl-synt。GGPPS蛋白二级结构与三级结构的主要结构元件是α-螺旋和无规则卷曲。同源性分析表明GGPPS蛋白具有很高的保守性,雷公藤(Tripterygium wilfordii)GGPPS蛋白与其余14种植物的亲缘关系较远。     

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建（摘要）

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽（TP）序列,并将其与高效植物表达载体p1304＋连接形成融合表达载体（p1304＋-TP）;冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌（EHA105-p1304＋-TP）。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。     

芥蓝牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因BoaGGPPS1的克隆及表达分析

本试验以芥蓝为试验材料,通过同源序列检索分析设计特异性引物,采用反转录PCR方法成功分离出芥蓝GGPPS1基因。BoaGGPPS1基因CDS全长为1 113 bp,编码370个氨基酸。生物信息学分析结果显示,BoaGGPPS1蛋白的等电点为6.07,相对分子量为39 790,不含跨膜结构域和信号肽。序列分析结果显示,BoaGGPPS1与其他植物GGPPS高度保守,与结球甘蓝的一致性最高,达到98%。系统进化树分析结果表明,BoaGGPPS1与十字花科其他植物的亲缘关系较近,与结球甘蓝的亲缘关系最近。BoaGGPPS1基因在芥蓝不同器官中均有表达,其中叶片中的表达量最高,根系中的表达量最低。构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-BoaGGPPS1,并对其进行诱导表达,结果发现该蛋白在大肠杆菌体内主要以包涵体的形式存在。     

银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体的构建

[目的]构建银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体。[方法]以银杏为材料,采用DNA重组技术克隆GGPPS基因质体转运肽（TP）序列,并将其与高效植物表达载体p1304＋连接形成融合表达载体（p1304＋-TP）;冻融法转化根瘤农杆菌EHA105,构建工程菌（EHA105-p1304＋-TP）。[结果]成功构建了银杏GGPPS转运肽与GFP融合基因表达载体及农杆菌工程菌。[结论]为进一步研究TP转运肽的亚细胞定位奠定基础,有助于阐明银杏内酯前体生物合成关键步骤的分子机理,同时为银杏内酯的代谢工程研究提供重要依据。     

地黄次生代谢产物生物合成基因表达水平与其含量的相关性分析

为了研究地黄次生代谢产物生物合成基因在不同地黄材料中的相对表达量,并分析其与次生代谢产物积累的关系,从地黄叶、地黄组培苗叶、地黄毛状根中提取总RNA,以地黄TIP41为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术分析梓醇、毛蕊花糖苷生物合成相关酶基因的表达量,并分别采用高效液相色谱法测定3种材料中梓醇和毛蕊花糖苷的含量、紫外分光光度法测定总环烯醚萜苷的含量,再对两者进行相关性分析。结果表明,3种不同地黄材料中次生代谢产物的生物合成相关酶基因的表达量及其含量差异较大。经相关性分析,地黄中梓醇的含量与GGPPS2基因的表达量呈显著正相关,总环烯醚萜苷的含量与GGPPS1、G10H基因的表达量也有显著相关性,说明GGPPS2与梓醇的合成有关,GGPPS1、G10H与总环烯醚萜苷的合成有关;而毛蕊花糖苷的含量与ADT、ASP5、4CL、C3H、HCT、GOT2基因的表达量均没有显著相关性。上述结果为地黄次生代谢产物生物合成途径的相关研究提供了参考。     

茉莉花JsGGPPS基因的克隆及生物信息学与表达分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(Geranylgerany pyrophosphate synthase,GGPPS)是萜烯类香气物质合成途径中的关键酶。采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆了茉莉花牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因的全长cDNA(命名为JsGGPPS,GenBank登录号AIY24421.1),采用实时荧光定量PCR技术分析JsGGPPS基因在茉莉花开放过程中的表达模式。结果表明,JsGGPPS全长cDNA为1 410bp,含1 083bp完整的开放阅读框(ORF),其推导的氨基酸序列包含360个氨基酸,属于trans-isoprenyl diphosphate synthases(IPPS)和class I terpene cyclases家族,含链长控制区(CLDR)、2个天冬氨酸富集区以及其他保守区。JsGGPPS基因与独行菜Lepidium apetalum、橡胶草Taraxacum kok-saghyz的同源性分别为91%、86%。实时荧光定量PCR结果表明,茉莉花开放过程中JsGGPPS基因在晚上18:00时表达量较低,呈上调趋势,在22:00时达到最高,呈下调趋势,在翌日2:00时表达量最低,与茉莉花释香趋势相似,为深入研究茉莉花萜烯类香气物质代谢途径奠定基础。     

番茄GGPS2基因的克隆与表达载体的构建

牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)在牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成、植物代谢和生长发育中具有重要作用.采用RT-PCR的方法,从番茄品种Solanum lycopersicon L.cv.Ailsa Craig成熟果实中扩增出GGPS2基因,分别构成了该基因的原核与植物表达载体.     

Techniques for Detecting Functional Protein Expression in Transgenic Plants

随着植物基因工程技术的发展,转基因植物日益增多。与此同时,转基阑植物检测技术的不断丰富和完善,促进了转基因植物科学鉴定和评价以及转基因植物商业化种植、笔者在蛋白质表达水平上对检测转基因植株的各种方法及发展状况作一概述和评价．     

腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建

[目的】构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体,进一步选育无标记的抗逆作物品种。[方法]利用腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体,将抗逆基凶与甘露糖正向选择系统结合。pmi基因植物表达载体（pPMI）的构建：用XhoI酶切植物表达载体pCAMBIA2301,切除Kan基因,并用CIP酶进行去磷酸化,然后与XhoI酶切后PCR产物连接转化。腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体（pPMI：：CpTIP）的构建：用和nI和Xbal酶切pPMI植物表达载体和克隆载体,并将酶切后pmi植物表达载体与腊梅花水通道蛋白CpTIP基因连接转化。转化鉴定均按Sambrook等的方法进行。[结果]成功构建了腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI：：CpTIP。[结论]所构建的载体结合了抗逆基凶和忖露糖正向选择系统的优点,将抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。     

香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用

为筛选出抗嗜水气单胞菌感染的天然化合物,以嗜水气单胞菌和香叶木素为研究对象,通过最小抑菌浓度测定、生长曲线、溶血试验、免疫印迹、荧光定量PCR和细胞毒性试验研究了香叶木素对嗜水气单胞菌气溶素表达的抑制作用。结果发现,对嗜水气单胞菌生长没有影响的香叶木素能在较低浓度下通过抑制气溶素的表达降低共培养物上清液的溶血活性;荧光定量PCR试验发现香叶木素能剂量依赖性地降低气溶素编码基因aerA 的表达。此外,通过活/死细胞染色发现香叶木素可减轻气溶素介导的细胞损伤。以上结果表明,香叶木素通过降低aerA的转录水平降低了嗜水气单胞菌的体外致病力,可作为一种抗嗜水气单胞菌感染的候选药物。     

基因工程与花生品种改良

基因工程与花生品种改良山东省花生研究所苗华荣应用基因工程进行作物改良，通常包含三项主要技术。一是目的基因的克隆、构建技术；二是将目的基因引入和稳定地整合到受体植物基因组内的植物基因转化技术；三是将转化的植物细胞或组织通过组织培养、选择和再生，获得转基...     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

转基因植物中的标记基因

随着转基因植物的商业化 ,植物转基技术将为农业生产带来一场新的革命。但目前仅仅把基因导入植物已经不能满足现代农业的要求。新的转化技术不仅要求把基因导入农艺性状优良的品种中 ,呈单拷贝 ,不带辅助序列 (标记基因 ) ,而且转基因的表达必需可预测 ,并在不同的转化体中表达一致。论文讨论标记基因及与标记基因消除的转化体系有关的问题     

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响

HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀(MEV)和膦胺霉素(FSM),测定烟草Nt HMGR、Nt DXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明,抑制剂处理后烟草内源基因Nt HMGR和Nt DXR表达量在24h受到明显抑制;HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。     

枫香叶片色素含量变化及其与叶色变化的关系

为了给城市街道秋季有色叶植物的选择和配置提供理论依据,于2005-08~2005-12采用比色法连续测量枫香叶片中叶绿素,类胡萝卜素和花色素苷的含量,并探讨其与叶色变化的关系。结果表明,在8~12月份,枫香叶片叶绿素含量总体上呈下降的趋势,叶绿素a和b含量以及a/b的变化趋势与叶绿素总量的变化趋势相似;随季节变化,枫香叶片中类胡萝卜素和花色素苷含量的变化不明显;随着气温的下降,花色素苷的颜色逐渐地表现出来,在2种色素的共同作用下,枫香叶片逐渐由黄绿色变成红色、深红色;枫香叶色与花色素苷/叶绿素总量呈正相关关系,而与叶绿素总量呈很高的负相关关系,与类胡萝卜素、花色素苷绝对含量的变化关系不大;叶片pH的降低也是叶片逐渐变红的一个原因。