共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

利用杆状病毒双表达系统构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）N蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒Bac—N—GP5,对重组病毒进行间接免疫荧光、Westernblot分析以及动物免疫试验。结果表明：重组杆状病毒中表达了重组N和GP5蛋白,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSVGP5蛋白和N蛋白的特异性抗体。本试验成功构建共表达PRRSVN蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为基因工程亚单位疫苗奠定基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在Sf9细胞中表达及免疫原性研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳(Cap)蛋白。将优化合成的PCV2 ORF2基因克隆到杆状病毒转移载体p Fast HTA中,并将鉴定正确的重组质粒p Fast HTA-Cap2转化至大肠杆菌感受态细胞,经蓝白斑筛选得到含有目的基因的重组杆状病毒质粒(r Bac-Cap2),转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒,对感染重组杆状病毒的细胞培养物进行重组蛋白的表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析,并对表达的重组蛋白进行小鼠免疫试验及其病毒血清中和试验。SDS-PAGE分析表明,优化合成的PCV2 ORF2基因得到表达,蛋白分子质量大小为33 ku;Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清,表明重组蛋白具有反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该蛋白能刺激机体产生特异性抗体,具有较好的免疫原性;病毒血清中和试验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1∶42。该蛋白在杆状病毒系统中的成功表达,为PCV2感染的诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒（swinepox virus,SWPV）作为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

表面展示猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S1的重组杆状病毒及其免疫效果研究

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白S1能够介导宿主抵御PEDV感染的中和抗体的产生,是PEDV基因工程疫苗研究的重要靶抗原。将PEDV的S1基因克隆至杆状病毒基因组中,构建包含PEDV S1基因的重组杆状病毒,使S1蛋白表面展示表达。以该重组病毒作为活载体疫苗皮下接种BALB/c小鼠,验证S1蛋白在重组杆状病毒中的表达及其免疫原性。Western blotting分析被重组杆状病毒感染的Sf9细胞中,PEDV S1蛋白能有效表达且呈现大小分别约120 k D和150 k D的2条带,其中前者至少比预期大30 k D左右,推测重组S1蛋白在Sf9细胞中被高度糖基化修饰。重组杆状病毒的胶体金免疫电子显微镜观测结果显示S1蛋白展示于杆状病毒表面;间接ELISA试验结果证明重组杆状病毒可以诱导产生PEDV特异性抗体,抗体效价达到1∶5 000。血清中和试验及淋巴细胞增殖试验结果证明,该重组杆状病毒能够激发有效的体液免疫及细胞免疫反应,S1蛋白在重组杆状病毒表面展示表达并具有免疫原性。     

口蹄疫病毒重组鸡痘病毒活载体疫苗和DNA疫苗免疫牛的试验研究

将本课题组构建的共表达FMDV衣壳蛋白前体P1—2A基因以及蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及共表达P1—2A和猪白介索18基因的重组DNA疫苗（pVIRIL18P1），分别以单独及混合的共3种方式接种牛，然后通过间接ELISA、中和试验和T淋巴细胞增殖试验评价其诱导的特异性体液和细胞免疫水平。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导牛产生特异性的体液及细胞免疫应答。其中重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫组以及联合免疫组（vUTAL3CP1／pVIRIL18P1，pVIRIL18P1／vUTAL3CP1）诱导的中和抗体滴度分别达到1：64、1：64和1：54，已接近于常规灭活疫苗水平（1：90），而特异性的T淋巴细胞增殖反应则比后者高得多（P〈0．01）。该研究结果为进一步进行免疫攻毒试验，并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础。     

HIV—2gag基因在重组痘苗病毒中的表达

以痘苗病毒ＨＡ基因为侧翼，将ＨＩＶ－２ｇａｇ基因部分序列（简称Ｇ１）和全部序列（简称Ｇ２）分别插入牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）和串联１０个（与ＨＡ基因反向）或１６个（与ＨＡ基因同向）痘苗病毒Ｐ７．５组成的复合型启动子下游，构建了４个重组痘苗病毒表达载体质粒。经脂质体转染、鸡红细胞吸附试验筛选和免疫荧光鉴定，获得４株能稳定表达目的蛋白的重组痘苗病毒。实验结果表明，以ＨＡ基因为侧翼构建重组病毒的重组率约为０．１％，阳性重组率为２５％～１００％。实验中还发现，以ＨＡ基因为侧翼的重组痘苗病毒能够引起细胞融合，其可作为筛选重组痘苗病毒的另一种标志。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，表达的Ｇａｇ蛋白能被ＨＩＶ－２血清中的特异性抗体所识别，并能诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｇａｇ抗体。     

HIV－1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达

Ｇａｇ蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）重要的结构蛋白，可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将ＨＩＶ－１不同长度的长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘病毒启动子控制下，经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定，分离了６株重组痘苗病毒。免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫酶试验检测表明，６株病毒均能表达ｇａｇ基因，其中以ｖ１６ＬＧ△２的Ｇａｇ蛋白表达量最高，占细胞裂解物上清的５．１９％，相当于１４．７μｇ／１０６细胞，接近杆状病毒的表达产量。重组蛋白主要为ｐ５５ｇａｇ蛋白前体，但也有一部分被加工，生成成熟蛋白ｐ２４ｇａｇ、ｐ１７ｇａｇ及其中间蛋白。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（ＶＬＰ），并可诱导小鼠产生抗Ｇａｇ蛋白抗体     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其在小鼠的免疫反应

猪伪狂犬病毒（PRV）是一种良好的兽用活病毒疫苗载体。但以PRY基因缺失疫苗株TK^-／gE^-／LacZ^＋为载体表达PRRSV GP5的重组病毒TK^-／gE^-／GP5^＋免疫实验动物后难以激发抗PRRSV的中和抗体。为了进一步增强这种重组病毒的免疫效力，本研究用具有更好免疫原性的修饰的ORF5基因（ORF5m）代替天然ORF5基因，构建了表达PRRSV的修饰型GP5m蛋白的重组伪狂犬病毒TK^-／gE^-／GP5m^＋。经PCR、Southem Blot、Western blot证实构建正确，并能表达具有活性的GP5m蛋白。将TX^-／gE^-／GP5m^＋与TK^-／gE^-／GP5^＋分别免疫Balb／c小鼠，结果TK^-／gE^-／GP5m^＋免疫小鼠不仅产生了较高水平的抗PRRSV的中和抗体（3／6只达到了1：16），而且在诱导PRRSV特异性细胞免疫方面也显著优于TK^-／gE^-／GP5^＋，表明TX^-／gE^-／GP5m^＋是一种极有希望的PRRSV和PRV二价基因工程候选疫苗。     

多联重组痘苗病毒的构建及鉴定

构建含有埃博拉出血热病毒(Ebola hemorrhagic fever virus,EHFV)小片段分泌蛋白S基因、马尔堡出血热病毒(Marburg hemorrhagic fever virus,MHFV)GP基因、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)G2糖蛋白基因及非洲欧尼恩病毒(Africa O’nyong nyong virus,O’NNV)E2蛋白基因的重组痘苗病毒。设计含EGFP筛选标记和4种外源基因的穿梭质粒,并利用同源重组技术、荧光筛选技术和Cre/LoxP敲除系统,最终获得四联重组痘苗病毒。使用PCR方法鉴定重组痘苗病毒及其遗传稳定性;用透射电镜观察病毒形态。结果显示:所构建的多联重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+具有良好的遗传稳定性,并且具备痘苗病毒的完整形态。结果表明:成功构建了含有4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+,为后续多联疫苗的研究奠定了基础。     

Study on Expression and Immune Effect of F Protein of Newcastle Disease Virus Type Ⅶ in Insect Cell

This experiment was conducted to study the protein expression of F gene of Newcastle disease virus (NDV) type Ⅶ by baculovirus expression system.The F gene was amplified by RT-PCR and cloned into pFastBac HT A plasmid, and then the recombinant plasmid was transformed into DH10Bac competent cells to get the positive recombinant bacmid.After 72 h transfection of Sf9 cell with recombinant bacmid, the expression of interest protein was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA), SDS-PAGE analysis and Western blotting. Serum antibody titers of immunized SPF chickens were determined by ELISA and the protective properties were determined by protection test. The results showed that F gene was expressed in Sf9 cells infected with the recombinant baculovirus. The expressed protein could induce high titer specific antibody against NDV. The protective rate of recombinant F protein group was 90%, which was significantly higher than that of the negative control group. These results laid a foundation for study on NDV subunit vaccine.     

基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

Induction of neutralizing antibodies against bovine leukosis virus in rabbits by vaccination with recombinant vaccinia virus expressing bovine leukosis virus envelope glycoprotein

Three kinds of recombinant vaccinia virus (RVV)--mO-HA/ATI, LO1-HA/ATI and mO-HA/7.5kD--expressing bovine leukosis virus (BLV) envelope glycoprotein (gp60) were constructed. The BLV envelope gene of RVV mO-HA/ATI and LO1-HA/ATI or of RVV mO-HA/7.5kD was expressed under control of the promoter of A-type inclusion body (ATI) protein gene of cow-pox virus or vaccinia virus 7.5-kD protein gene, respectively. The vaccinia virus strain, LC16mO, was used as vector for RVV mO-HA/ATI and mO-HA/7.5kD, and strain LO-1 was used for RVV LO1-HA/ATI. Strains LC16mO and LO-1 are attenuated vaccine virus strains originating from the Lister original vaccinia virus. All 3 kinds of constructed RVV expressed gp60 in cultured rabbit kidney cells after infection; mO-HA/ATI expressed more antigen than did mO-HA/7.5kD. Rabbits vaccinated with RVV produced considerable antibody capable of inhibiting syncytium formation, as well as antibody with virion-binding ability. The RVV that used ATI promoter induced higher antibody titer than did the RVV that used 7.5-kD promoter. Results indicate that BLV gp60 is responsible for induction of neutralizing antibodies that suppress in vitro formation of syncytia among BLV-infected cells. Applicability of RVV, especially those using ATI promoter, was evaluated in a vaccine against bovine leukosis.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HB-3株GP5-M-N蛋白核酸疫苗的构建及免疫原性

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸疫苗用于免疫预防的可行性,试验用PCR方法扩增出PRRSVHB-3株GP5、M和N基因,通过I,inker序列将GP5和M串联为GP5-M,双酶切后和N基因-起插入真核表达载体构建重组质粒pcDNA-GP5-M-N,经酶切鉴定表明GP5、M和N基因和载体连接正确。然后将重组质粒转染至Marc-145细胞,经间接免疫荧光及Western blot分析证实重组蛋白能在Marc-145细胞中表达。然后用重组质粒pcDNA-GP5-MN免疫Balb／c小鼠,中和抗体检测结果表明,首免后2周即有小鼠产生可检测到的病毒中和抗体（1：4）,随后抗体水平快速升高,第8周抗体效价达到最高（1：32）。说明本试验构建的重组质粒pcDNA-GP5-M-N能诱发免疫小鼠产生较高水平的中和抗体,为PRRSV核酸疫苗的研究奠定了基础。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。     

以伪狂犬病病毒(Bartha-K61)为载体正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白重组疫苗的构建

构建以伪狂犬病病毒Bartha-K61株为载体的正向表达狂犬病病毒(8202株)糖蛋白的重组活载体疫苗.将eGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Mlu Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为正向连接,阳性重组子命名为p8AA-eGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/eGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的滴度(TCID_(50))为10~(8.125)/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性;通过构建表达狂犬病病毒糖蛋白正向重组Bartha-K61的活载体疫苗的研制,为狂犬病疫苗的研制与开发奠定基础.     

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Yp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果.结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用.首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力.     

马传染性贫血病病毒核心蛋白基因的克隆和表达

根据美国马传染性贫血病病毒（EIAV）Wyoming株基因序列,设计扩增EIAVgag和p26基因的引物,用PCR法能忠实的分别扩增出全长gag和p26基因。经用杆状病毒表达系统对所获gag和p26基因进行克隆和重组,获得了高效稳定表达Gag和p26蛋白的重组杆状病毒（rBVs）。含有gag和p26基因的重组杆状病毒感染昆虫Sf21细胞,经无血清昆虫细胞培养基增殖和纯化,每升培养物能获得2mgCag或12mgp26蛋白。