中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记的克隆及序列分析

对获得的中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记OPW02-1756、OPO11-964、OPY13- 661、OPB11- 520、OPW05-766、OPV03-1365和OPJ16-759进行了回收、克隆、测序及序列分析。结果表明,7个RAPD标记的实际长度分别是1756bp、964bp、661bp、520bp、766bp、1365bp和759bp。OPW02-1756序列与3条欧洲葡萄cDNA克隆获得的EST序列有94 ~ 98%的同源性。OPO11- 964序列与欧洲葡萄“赤霞珠”的1条EST序列有93%同源性,与“霞多丽”的2条果实不同发育时期获得的EST序列有90%和87%的同源性,与甜橙在多种病原菌侵染后通过cDNA文库获得的1条EST序列有83%的同源性。OPO11-964最大的一个阅读框架包含444个碱基,编码147个氨基酸,该氨基酸序列和21个其它生物的未知功能蛋白序列有部分相似性。OPY13-661序列与欧洲葡萄16条EST序列有同源性,其中与“赤霞珠”cDNA克隆的EST有较高的同源性, 与“霞多丽”的2条叶片非生物胁迫有关的EST序列同源性均为89%。OPB11-520序列与拟南芥基因组4条未知功能DNA序列有94%同源性。OPW05-766序列与来自于酿酒葡萄的GAG-POL 前提有50%的同源性。OPV03-1365序列与水稻基因组6条序列有81 ~ 88%的同源性,与拟南芥基因组3条序列有84 ~ 91%的同源性。OPJ16-759与欧洲葡萄“霞多丽”叶片14条非生物胁迫EST序列有83 ~ 100%的同源性,与欧洲葡萄“Cabsau”浆果3条水分胁迫的EST序列有94 ~ 100%的同源性。     

高羊茅甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因FaGAPDH的克隆与分析

以高羊茅茎基部与叶基部的mRNA为模板,引用基于多年生黑麦草GAPDH基因序列设计的引物,进行RT-PCR分析,同时结合3＇RACE和5＇RACE方法从高羊茅中扩增出两个GAPDH基因,命名为Fa-GAPDH1（GQ480772）与FaG4PDH2（GQ480773）。两序列cDNA全长分别为1281bp和1348bp,具有完整的开放阅读框（ORF,FaGAPDHI：74～1087bp;FaGAPDH2：106～1119bp）,编码蛋白都为337个氨基酸。保守结构域功能分析表明两基因编码的蛋白质都具有典型的Rossman—NAD连接折叠和C-末端结构域。FaGAPDH1和FaGAPDH2蛋白与禾本科植物的该基因蛋白产物比较发现氨基酸序列的同源性都在90％以上,说明两基因具有高度的保守性。     

钝齿棒杆菌精氨酸生物合成相关基因簇argCJBDFR的扩增及序列分析

采用PCR方法扩增钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR,其序列长为6080bp,其中含有argJ、argB、argD、argF和argR5个完整的开放阅读框。序列和结构分析表明这5个结构基因编码的氨基酸序列与谷氨酸棒杆菌的相应基因编码的氨基酸高度同源,同源性分别为92%、95%、96%、97.5%和100%。     

甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

中华蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2基因的克隆与序列分析

从中华蜜蜂（Apis cerana cerana)和意大利蜜蜂（Apis mellifera)工蜂毒腺中快速抽提总RNA，用RT-PCR方法分别扩增各得到约含470bp的cDNA片段，将这2个片段克隆入PGEM-T载体，进行测序和序列分析，结果表明，这2个片段均含有405bp、编码蜂毒PLA2成熟肽的cDNA，并分别由cDNA推导出两者所编码的氨基酸序列，经序列比较，中蜂PLA2与意蜂PLA2具有95%的同源性，与大蜜蜂PLA2、美国熊蜂PLA2及黑腹果蝇PLA2的同源性分别为90%、54%、39%。     

齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ALDH21的克隆与表达分析

本文采用RT-PCR方法,从齿肋赤藓（Syntrichia caninervis）总RNA中获得ALDH21基因cDNA序列,连接到pMD19-T载体上并转化E.coli DH5α,阳性克隆经PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中山墙藓（Tortula ruralis）和小立碗藓（Physcomitrella patens）相关基因序列进行同源性比对。结果表明,实验成功克隆了S.caninervis的ALDH21基因的cDNA序列（GenBank登录号：GQ245973）,为一个完整的ORF,其长度为1452bp。该序列与T.ruralis和P.patens的cDNA序列同源性分别为98%和78%,推导的氨基酸同源性分别为97%和87%。生物信息学分析表明该蛋白质分子量为52.98kD,等电点pI为5.96,编码483个氨基酸,具备ALDH21蛋白家族特征;半定量RT-PCR结果表明：ALDH21在干旱胁迫状态时的表达量显著高于水合状态,说明ALDH21基因可能参与干旱胁迫应答。本文为进一步研究齿肋赤藓ALDH21基因的抗旱机理提供理论依据。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色.本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica) GR基因的cDNA全长并分析其组织表达谱.参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的cDNA序列.测序结果表明,鸽子GR基因包含有2313bp的全长CDS序列,102bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(GenBank登录号:NM001037826.1).通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94％,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85％,与人(Homo sapiens)的同源性为75％.通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain, LBD),此外还包括一个GR特异区域.利用qRT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊.睾丸中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),其次为胰腺和肺(P＜0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P＜0.05).本研究获得鸽子GR基因cDNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料.     

花生fw2.2基因的克隆及遗传转化

fw2.2基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究以番茄fw2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物对花生进行扩增,目标产物测序后,将推测的氨基酸序列与其他植物fw2.2基因编码的氨基酸序列进行比对,同源性为34.78%～66.8...     

银杏EST序列中微卫星的分布特征

本文利用从NCBI下载的21590条银杏EST序列,分析了银杏（表达序列标签微卫星）EST-SSR在银杏EST序列的分布和比较了在不同长度EST序列中的SSR特性。在剔除冗余和低质量序列后,得到总长为5708.385kb的无冗余EST序列7961条,发现了405个EST序列（5.09%）含有475个SSR,长度400~1000bp的EST序列含SSR位点数为445个,占SSR总数的93.68%。二核苷酸和三核苷酸基元类型是银杏EST-SSR的主要类型,分别占SSR总数的73.89%和24.00%,最常见的SSR基元是：（AT）n、（AG）n、（AC）n、（AAG）n和（AAT）n。通过对银杏EST序列中SSR位点信息的发掘分析,为有针对性地设计EST-SSR引物,开发银杏EST-SSR分子标记奠定基础。     

Isolation and Analysis of Genes Induced by Rehydration after SeriousDrought in Broomcorn Millet (Panicum miliaceum) by Using SSH

利用抑制消减杂交(suppression subtraction hybridization，SSH)技术构建了糜子(Panicum miliaceum)干旱后复水条件与正常浇水条件下基因差异表达的SSH-cDNA文库。对其中的60个阳性克隆进行了测序，在去除冗余的cDNA后，利用NCBI的BLAST软件在GenBank 中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。核酸比对结果表明,有32个cDNA片段与已知cDNA片段具有较高的同源性，且多数与植物受到生物或非生物胁迫时的反应机制相关，同时有11条序列与小鼠肝被手术切除后再生时产生的EST有一定同源性。蛋白分析结果显示，有28个序列与已知功能蛋白序列同源性较高，这些功能蛋白涉及植物体内的信号转导、转录调控及蛋白加工等。实验结果表明糜子在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达。     

陆地棉巯基蛋白酶抑制剂基因克隆及其氨基酸序列分析

通过对植物中已知巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)的保守性分析,设计1对简并引物,从陆地棉栽培种中棉所29(GossypiumhirsutumL.cv.Zhongmiansuo29)cDNA中克隆出1条巯基蛋白酶抑制剂基因片断,经测序和对测序结果在有关数据库中检索分析,发现该片段与1条中棉(G.arboreumL.)EST及1条雷蒙德氏棉(G.raimondiiL.)cDNA同源性高达96%。三者编码蛋白的氨基酸同源性达100%,且完全符合CPI的特征;所克隆基因片段的氨基酸序列与NBCI蛋白质数据库中登录的豇豆、向日葵、玉米、水稻中CPI均有高度同源性,表明该片段包含编码陆地棉CPI的完整序列。     

陕229干旱复水诱导基因表达及小麦乙烯受体(TaERS)基因特征分析

为了解小麦响应水分胁迫后复水条件下的基因表达特征,以小麦(Triticum aestivum L.)主栽品种陕229的3叶1心期幼苗为材料,采用消减杂交技术,构建了干旱复水条件下的SSH-cDNA表达文库。从消减文库中随机挑选59个插入片段大于400bp的阳性克隆测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得高质量EST序列32条(GenBank登录号为ES466767~ES466798)。序列比对分析表明,小麦干旱后复水的基因表达与植物对其他非生物胁迫的响应具有交叉性;17条EST序列与已知编码蛋白的基因同源性较高,涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控等方面;其他序列为新的EST。以其中一个与乙烯受体基因(ERS)同源性较高的EST序列为基础,采用同源克隆及RACE技术从小麦中分离了4个乙烯受体基因的全长cDNA序列,长度分别为2090、2271、2216和1886bp。4个全长cDNA序列所编码氨基酸序列的同源性极高(99%以上),且均具有ERS典型的GAF、HisKA和HATPase-c跨膜结构,分别命名为TaERS1(HM347272),TaERS2(HM601437),TaERS3(HM601438)和TaERS4(HQ111523)。植物ERS氨基酸序列多重比较表明,小麦与水稻的相似性最高(93%);TaERS基因的全长cDNA序列间比较共发现SNP位点23个。定量PCR表达分析显示,小麦TaERS家族基因参与了小麦植株响应水分胁迫和复水的调控机制。研究结果有助于进一步认识小麦干旱后复水的基因表达谱和小麦水分高效利用机制,探索小麦乙烯受体在水分高效利用中的作用。     

基于微处理器的红外监测系统识别母猪发情

正确识别母猪正常发情是获得母猪适期配种时间和提高其受胎率的技术关键。目前大部分种猪场识别母猪发情仅依靠人工观察的手段来完成。该文介绍了采用微处理器控制的红外监测系统自动识别母猪的发情。详述了该系统的结构设计，包括红外传感与检测电路的设计，微处理器的红外信号采集与存储电路的设计等，以及用于识别母猪发情的应用原理。该系统在经过种猪场现场测试，分析其试验结果后表明：红外监测系统识别母猪正常发情的准确率达到80％以上，并可有效地减少了母猪非生产繁殖的天数与投入的人工费用。     

基于隐马尔科夫模型的深度视频哺乳母猪高危动作识别

哺乳母猪的高危动作和仔猪存活率有密切关系,能直接体现其母性行为能力,而这些高危动作又与其姿态转换的频率、持续时间等密切相关。针对猪舍环境下,环境光线变化、母猪与仔猪黏连、猪体形变等给哺乳母猪姿态转换识别带来的困难。该文以梅花母猪为研究对象,以Kinect2.0采集的深度视频图像为数据源,提出基于Faster R-CNN和隐马尔科夫模型的哺乳母猪姿态转换识别算法,通过FasterR-CNN产生候选区域,并采用维特比算法构建定位管道;利用Otsu分割和形态学处理提取疑似转换片段中母猪躯干部、尾部和身体上下两侧的高度序列,由隐马尔科夫模型识别姿态转换。结果表明,对姿态转换片段识别的精度为93.67%、召回率为87.84%。研究结果可为全天候母猪行为自动识别提供技术参考。     

融合2D-3D卷积特征识别哺乳母猪姿态转换

母猪姿态转换影响仔猪存活率,且动作幅度与持续时间存在差异,准确识别难度大。该研究提出一种融合2D-3D卷积特征的卷积网络(2D+3D-CNet,2D+3D Convolutional Network)识别深度图像母猪姿态转换。以视频段为输入,引入注意力机制SE模块和3D空洞卷积,以提升3D卷积网络姿态转换的时空特征提取能力,用2D卷积提取母猪的空间特征;经特征融合后,动作识别分支输出母猪转换概率,姿态分类分支输出4类姿态概率,结合这两个输出结果识别8类姿态转换,减少了人工标注数据集的工作量;最后设计动作分数,优化母猪姿态转换的时间定位。在测试集上,2D+3D-CNet姿态转换识别精度为97.95%、召回率为91.67%、测试速度为14.39帧/s,精度、召回率和时间定位精度均高于YOWO、FRCNN-HMM和MOC-D方法。该研究结果实现了母猪姿态转换高精度识别。