圆纹广翅蜡蝉产卵规律及温度对越冬卵发育的影响

为了阐明圆纹广翅蜡蝉（Pochazia guttifera Walker）产卵对茶树的为害规律及温度对其越冬卵发育的影响,通过五点取样法,系统调查了圆纹广翅蜡蝉产卵对茶树的为害情况,并研究了16、19、22、25、28℃恒温对圆纹广翅蜡蝉越冬卵发育的影响。结果表明,圆纹广翅蜡蝉成虫喜欢在直径为(0.23±0.04)cm的茶树幼嫩枝条上产卵,产卵刻痕在枝条上的为害长度为(1.36±0.59)cm。在茶园周围有较多寄主林木且管理较为粗放的马鞍山茶叶试验场阶梯茶园内,茶树枝条的受害率为13.35%,显著高于其他茶园。此外,越冬卵的发育历期,随着温度的升高逐渐缩短,28℃处理的越冬卵发育历期为(28.75±7.03)d,若虫初孵时间较早,孵化率较高。温度与圆纹广翅蜡蝉越冬卵发育速率关系满足方程y=0.001 9x–0.022,越冬卵的发育起点温度为11.58℃,有效积温为526.32 d·℃。本研究对信阳茶区圆纹广翅蜡蝉越冬种群发生期的预测预报和防控策略的制定具有重要的指导意义。     

缘纹广翅蜡蝉越冬卵空间分布型及抽样技术研究

缘纹广翅蜡蝉最近几年在江苏茶区严重危害茶树,并且为害其它植物如香樟、柑橘等。缘纹广翅蜡蝉一年发生1～2代,多以卵在嫩梢内越冬,少数以成虫在茶丛中越冬。春季越冬卵孵出若虫刺吸为害芽梢,并分泌蜡丝。6、7月间成虫盛发,在茶丛间飞动活跃,刺吸为害夏秋季嫩梢,并刺裂枝梢皮层产卵导致芽梢枯竭。本文对缘纹广翅蜡蝉越冬卵空间分布型及抽样方法作了研究和探讨。     

信阳茶树新害虫——蜡蝉

蜡蝉原来主要为害果树,特别是柑桔类果林,近几年开始为害茶园,并有逐年上升的趋势。笔者通过近3年在信阳茶园长期跟踪调查,并采用塑料网套虫饲养方法,发现信阳茶园蜡蝉优势种有柿广翅蜡蝉、八点广翅蜡蝉、碧蛾蜡蝉。现将它们的主要区别概述如下。     

豫南茶园柿广翅蜡蝉生物学特性

柿广翅蜡蝉（Ricania sublimbata Jacobi）,属同翅目广翅蜡蝉科。其寄主很广,除为害茶树外,还为害柑桔、苹果、桃、柿、椿、构树、桂花等几十种果木园林花卉植物。笔者在对豫南茶园病虫害调查研究中发现,不论是幼龄茶园还是成龄茶园,不论山地茶园还是平地茶园,都发生有柿广翅蜡蝉为害,其分布范围逐年扩大,为害逐年加重,已上升为豫南茶园主要害虫之一。近年来,笔者对豫南茶园柿广翅蜡蝉形态特征、生物学特性等进行了调查研究,现将其总结如下：     

不同施氮量对两种茶园土壤硝化作用和pH值的影响

在土壤最大持水量60%和温度25℃的实验室培养条件下,对采自福建武夷山的两种类型土壤（黄壤和红壤）进行46βd的培养实验,研究了不同施氮量对茶园土壤硝化作用和pH值的影响。结果表明,两种茶园土壤中尿素的水解过程有明显差别,黄壤茶园土壤中尿素水解率高且较快（2~6βd）,红壤茶园中水解过程达到了16βd;对照处理（N0）两种茶园硝化率分别为81.32%和73.48%,黄壤茶园土壤硝化作用显著高于红壤茶园（P<0.05）;无论施氮与否,两种茶园土壤NO₃^--N含量随时间的变化趋势呈“J”型,具有11~16βd的延滞期,符合指数方程N=N₀e^kt（P<0.01）;施氮后,两种茶园土壤的净消化量、净硝化速率和k值（P<0.05）均显著增加,且随施氮量的增加而增加,但土壤硝化率（P<0.05）显著降低;无论施氮与否,黄壤茶园土壤N₂O排放速率在培养期间总体高于红壤茶园土壤,且前者累积排放量显著高于后者（P<0.05）;氮肥施用导致两种茶园土壤pH值下降,较对照分别下降了0.16~0.52和0.11~0.25,施氮量越大,pH值下降越多。以上结果表明,研究中两种茶园土壤硝化作用较强,均存在硝化作用延滞期（11~16βd）,有利于茶树对铵态氮的吸收利用;施氮导致土壤pH值降低,加速土壤酸化。     

茶树生长素受体基因CsTIR1的克隆与表达分析

吲哚-3-乙酸（又称IAA或生长素）,在植物生长发育中具有重要的调控作用,其作用主要通过信号转导途径来完成。生长素受体是其信号转导的关键元件之一。本研究通过RACE克隆,获得了茶树中生长素受体CsTIR1基因的cDNA全长序列（NCBI登录号：JX050147）。CsTIR1序列全长2β315βbp,含1β746βbp的完整开放阅读框,编码581个氨基酸,预测分子量65.18βkD,理论等电点（pI）5.64。茶树CsTIR1与烟草TIR1的相似性最高达82%,亲缘关系最近。CsTIR1含有1个F-box结构域和6个LRR结构域,三级结构形如“蘑菇状”。CsTIR1在茶树的根、茎、叶和花中具有组织表达特异性;其表达受IAA诱导,3种不同浓度的IAA均能诱导CsTIR1上调表达,且在50βμmol·L^-1浓度下表达量最大;ABA、GA3、MeJA和BR等激素也能够显著上调其表达;CsTIR1在越冬休眠芽中的表达量低,在活跃期中上调表达。     

小贯小绿叶蝉半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

半胱氨酸蛋白酶是植食性昆虫体不可或缺的重要水解蛋白酶之一。本文从小贯小绿叶蝉的转录组数据库中获得半胱氨酸蛋白酶基因Eocyp的基因片段的转录本序列,利用RACE技术得到其cDNA全长序列,利用生物信息学技术对Eocyp所编码的理论氨基酸序列进行分析,使用qRT-PCR技术检测Eocyp在小贯小绿叶蝉不同发育阶段,雌、雄成虫不同部位以及不同温度和光周期下的表达量。结果表明,小贯小绿叶蝉Eocyp的全长cDNA序列包含一个1β656βbp的开放阅读框,编码551个氨基酸,并具有由24个氨基酸残基组成的信号肽。推测其相对分子量为62.09βkD,预测其分子式为C₂₇₈₂H₄₁₆₃N₇₃₇O₈₃₅S₂₅;理论等电点为6.02,不稳定系数为36.10。Eocyp具有半胱氨酸蛋白酶基因的典型特征,即催化三联体Cys³⁵⁷-His⁴⁹⁹-Asn⁵¹⁹,同时具有ERFNIN,GNFD和GCDGG簇等保守结构域。Eocyp编码氨基酸序列与茶翅蝽CYP基因编码序列相似度最高。表达特征分析结果表明,Eocyp在小贯小绿叶蝉的各个生长时期均有表达,在5龄若虫时期达到最高;Eocyp在小贯小绿叶蝉雌、雄成虫的腹部均有较高的表达量;然而,Eocyp的表达量对于高、低温和不同光周期均无响应。这些结果为进一步研究Eocyp功能提供了理论依据。     

茶树CsMYB基因启动子的克隆与功能分析

以茶树新品系“1005”嫩芽为材料,克隆得到CsMYB基因gDNA全长序列1β828βbp,通过染色体步移技术,分离得到CsMYB基因启动子片段1β038βbp,命名为proMYB。生物信息学分析表明,CsMYB gDNA由2个内含子和3个外显子组成,该启动子含有与提高基因转录水平相关的5′UTR Py-rich stretch顺式作用元件、启动子核心元件TATA-box和CAAT-box,还存在有激素响应元件、光响应元件、逆境应答元件以及大量功能未知或功能特异的顺式作用元件,说明proMYB具有诱导型启动子特性,CsMYB基因在茶树植物体中可能参与多种非生物胁迫应答和激素信号传导;通过烟草的瞬时表达结果表明,该启动子能驱动下游基因表达,具有启动子活性。     

茶氨酸生物合成工程菌构建

通过PCR扩增E.coli DH5α的γ-ggt基因,产物经纯化后用Kpn I和Xho I双酶切,回收γ-谷氨酰转肽酶基因目的片断,并与经相同双酶切的表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-GGT。将重组质粒转化到E.coli BL21中,获得工程菌。工程菌株经0.05βmol/L IPTG,32℃诱导表达,湿菌体的酶活达到2.0βU/g,大约是出发菌株E.coli DH5α的15倍。工程菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到29.40βg/L,L-Gln的转化率为48.22%,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力比出发菌株E.coli DH5α提高了100多倍。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

基于CFD和RSM的红茶萎凋机性能参数优化

为探明萎凋机结构参数对萎凋性能的影响特性,通过流体力学软件进行萎凋环境的数值模拟分析,以无量纲化后的温度场综合指标作为萎凋性能优劣的评判指标,并采用响应面法（RSM）对影响萎凋性能的3个因素（萎凋机层高x₁、萎凋机与萎凋房空间距x₂、气路位置x₃）进行优化。结果表明,各因素对萎凋品质的影响重要性顺序依次为：气路位置>萎凋机层高>空间距;当萎凋机层高、空间距、气路位置分别为0.1、0.1、1.496βm时,红茶萎凋机温度场性能最优,所建模型决定系数为0.968β3,调整后的决定系数为0.927β5,标准偏差为0.061,最优方案理论值和实际值分别为：0.951β9和0.909β6。CFD和RSM融合分析方法,适用于红茶萎凋机的性能参数优化。     

超高效液相色谱-串联质谱联法测定茶园用农药制剂中烷基酚聚氧乙烯醚含量

建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定茶园用农药制剂中烷基酚聚氧乙烯醚(APEOs)的检测方法。APEOs经Waters-BEH C₁₈色谱柱分离,电喷雾正离子源(ESI+)条件下多反应监测模式(MRM)测定,外标法定量。APEOs(n=3～20)在水剂、水乳剂、悬浮剂、乳油、颗粒剂和可湿性粉剂中的基质标准曲线在0.047～1503.6 mg·kg^-1范围内线性关系良好,相关系数(r)为0.996 1～0.999 9;在0.5～1 503.6 mg·kg^-1添加范围内,添加回收率为83.8%～120.4%,相对标准偏差(RSD)为0.6%～13.7%,LOQ为0.5～150.4 mg·kg^-1。测定的51种茶园农药制剂中,辛基酚聚氧乙烯醚(OPEOs)百分数含量均低于0.5%;壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)质量分数为ND～32.1%,检出率90.2%,NPEOs在茶园用农药中应用普遍。     

冠突散囊菌和植物乳杆菌联合发酵对绿茶液态饮料品质的影响

为了抑制冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料中儿茶素的降解,本研究采用植物乳杆菌和冠突散囊菌对绿茶液态饮料进行联合发酵,试验通过响应面法优化了联合发酵绿茶液态饮料工艺,并采用高效液相色谱（HPLC）法和顶空固相微萃取串联气质联用（HS-SPME/GS-MS）法分别检测了联合发酵绿茶液态饮料中儿茶素含量和香气成分。结果表明,在干茶添加量10βg·L^-1、冠突散囊菌添加量10βmL·L^-1的前提下,联合发酵绿茶液态饮料的最佳工艺条件为植物乳杆菌添加量20βmL·L^-1、蔗糖添加量75βg·L^-1、30℃下静置发酵3βd。在此工艺下联合发酵绿茶液态饮料中总儿茶素含量为1β419.94βμg·mL^-1,与冠突散囊菌发酵绿茶液态饮料（848.72βμg·mL^-1）相比,显著增加（P<0.05）;且醇类化合物（30.27%）、醛类化合物（15.25%）、烃类化合物（11.35%）、酯类化合物（9.86%）和酮类化合物（9.01%）含量与未发酵绿茶液态饮料相比均显著增加（P<0.05）。     

茶树Na+/H+逆向转运蛋白基因CsNHX1、CsNHX2的克隆及表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（Na⁺/H⁺ antiporter,NHX）在植物生长发育与逆境响应过程中扮演着重要角色。本研究以龙井长叶茶树品种为材料,克隆获得了茶树CsNHX1和CsNHX2基因cDNA全长序列,GeneBank登录号分别为：MG722977和MG515211。生物信息学分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2的cDNA全长分别为1β691βbp和1β757βbp,均包含1个1β626βbp的开放阅读框,编码541个氨基酸,预测分子量为59.5βkD和59.7βkD,理论等电点为7.07和8.79;蛋白序列分析结果显示,CsNHX1和CsNHX2属于典型的跨膜蛋白,均含有保守的Na⁺/H⁺ Exchanger结构域;进化树分析显示,CsNHX1和CsNHX2均为IC类中定位于液泡膜上的Class I成员。qRT-PCR结果显示,干旱、低温和盐胁迫能够显著诱导CsNHX1和CsNHX2上调表达;外源ABA处理下,CsNHX1和CsNHX2表达水平整体变化趋势不显著;高温胁迫处理下,茶树CsNHX1表达水平显著降低,而CsNHX2表达水平逐渐增加,表明茶树CsNHX1和CsNHX2参与了茶树对多种环境胁迫的响应过程,但对于不同逆境胁迫的应答模式存在一定差异。     

茶园昆虫群落多样性和时间格局分析

为明确茶园害虫群落多样性、优势种与昆虫群落的时间格局,对山东省代表性茶园的主要害虫及天敌群落特征进行研究.通过目测法、黄板法、扫网法以及室内观察法,进行害虫和天敌的种类鉴定以及数量统计,共发现害虫(包括害螨)27种,天敌(包括蜘蛛)15种.茶园的主要优势种害虫有黑刺粉虱、小贯松村叶蝉、茶蚜、绿盲蝽与茶黄蓟马.主要优势天...     

茶树PPO基因家族的鉴定与分析

多酚氧化酶（Polyphenol oxidases,PPO）是由核酸编码的一种以氧为受体的含铜金属酶,为一种末端氧化酶,在茶叶加工中也发挥重要的作用。从最新发布的茶树基因组数据库中获得了5条PPO基因：CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3、CsPPO4（GenBank登录号为GQ129142.1）、CsPPO5。本研究利用生物信息学方法,对5条基因的核酸序列和氨基酸序列进行分析,并对基因编码蛋白的理化性质和结构功能进行预测。结果表明,5个基因CDS区全长在597~1β839βbp之间,编码氨基酸数目198~612;系统进化树分析显示CsPPO1、CsPPO3、CsPPO4和CsPPO5具有较近的亲缘关系;编码的蛋白均属于亲水性不稳定类脂类结合蛋白,都不具有信号肽;无规则卷曲是蛋白质的主要结构元件,α-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中,CsPPO1、CsPPO2、CsPPO3可能存在一个或多个跨膜螺旋;5个蛋白均含有PPO1_DWL（pfam12142）保守结构域,除了CsPPO2外,其余4个蛋白均预测到TYROSINASE功能结构域。实时定量PCR结果表明,PPOs基因在不同茶树品种间呈现出不同的表达模式。     

茶树CsMDHAR基因的克隆与非生物胁迫响应分析

基于茶树转录组数据,以龙井43茶树cDNA为模板,克隆得到开放阅读框（ORF）长度为1β305βbp,编码434个氨基酸的茶树单脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为CsMDHAR。蛋白序列特征和基因表达模式分析表明,CsMDHAR蛋白含有FAD结合功能域,属于FAD依赖的吡啶核苷酸-硫基氧化还原酶（Pyr-redox-2）家族。该蛋白有两个无序化区域,而且包含有32个磷酸化位点,理论相对分子量为47.21βkDa,pI为5.99,属于亲水性蛋白;CsMDHAR蛋白二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。通过PlantCARE和PLACE对启动子上游调控元件进行分析预测,结果显示,CsMDHAR基因启动子上游1β000βbp中含有多个与光、激素以及植物抗逆有关的顺式作用元件。利用荧光定量PCR方法检测龙井43和迎霜的CsMDHAR、CsAO和CsAPX在4种不同非生物胁迫下的表达水平,结果表明,在低温（4℃）胁迫下,两个茶树品种的CsMDHAR、CsAO和CsAPX的表达均受抑制,且品种间的差异较小;在高温（38℃）和干旱（200βg·L^-1 PEG）胁迫下龙井43中的CsMDHAR表达均上调,分别在8βh和2βh时达到最大值,为对照的1.49倍和1.85倍;盐（200βmmol·L^-1 NaCl）胁迫下,CsAO和CsAPX在两种茶树品种中的表达量变化趋势相似,但变化幅度不同,可能与品种间不同的抗逆性有关。     

14种植物精油对茶尺蠖行为的影响

为获得能够应用于茶园茶尺蠖Ectropis obliqua“推—拉”策略的行为调节剂,在室内测定了茶尺蠖成虫对14种植物精油的趋性反应,及植物精油对茶尺蠖雌虫产卵行为的干扰作用,并采用叶碟法测定了植物精油对茶尺蠖幼虫的拒食作用。结果表明,罗勒、迷迭香、肉桂、茴香及天竺葵5种植物精油对茶尺蠖成虫表现出一定的驱避活性,并且迷迭香油和天竺葵油还能显著干扰雌虫的产卵活动。在3个浓度处理下,茴香、罗勒和藿香植物精油对茶尺蠖3龄幼虫表现出显著的拒食活性。随着精油处理浓度的升高,茶尺蠖幼虫的拒食率升高,生长率随之下降。试验结果证明迷迭香、罗勒、茴香及天竺葵等植物精油对茶尺蠖具有显著的行为调控功能,具备作为茶尺蠖防控剂开发的潜力,值得进一步研究。     

茶鲜叶中多环芳烃类化合物的分布特性研究

利用高效液相色谱法分析了不同季节、不同茶树品种、不同部位茶鲜叶中16种多环芳烃（PAHs）的分布特性。结果表明,3个茶树品种,以政和大白茶鲜叶原料中PAHs的含量和标准偏差值最小,平均含量为126.92 μg·kg^-1,偏差值为17.59 μg·kg^-1;不同部位茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值表现为芽<第二叶<第四叶<第六叶,芽头PAHs含量为119.13 μg·kg^-1,标准偏差值为14.36 μg·kg^-1;不同季节茶鲜叶中PAHs含量及标准偏差值呈现秋<春<夏的分布特性,秋季茶鲜叶中PAHs的含量为112.75 μg·kg^-1,标准偏差值为11.97 μg·kg^-1;同时茶鲜叶中16种PAHs主要以2、3环PAHs为主,占PAHs总量的80%左右,4~6环PAHs相对较少。