抑菌圈-定殖力双重测定法筛选青枯病生防细菌

 本研究首先用平皿抑菌圈法筛选出55个拮抗青枯菌的细菌菌株,将番茄幼苗在各菌菌悬液中浸根12h后栽种于温室未灭菌的土壤中,结果发现,有22个菌株在幼苗根部的定殖能力较强(终定殖密度大于104 cfu/g根),其中革兰氏阴性土壤细菌占同类菌的86.3%,革兰氏阳性土壤细菌占同类菌的13.0%,10个无致病力产细菌素的青枯菌菌株在根部的终定殖密度均低于104 cfu/g根,其定殖能力弱于致病青枯菌。有17个拮抗菌菌株在番茄幼苗根部的定殖密度超过所有致病菌。温室生防结果证明,抑菌圈-定殖力双重测定法对于筛选生防菌株是一种行之有效的方法。     

辣椒疫霉生防菌的双重筛选

利用抑菌圈-定殖力双重测定法进行辣椒疫霉拮抗菌筛选。结果表明:有6株拮抗菌(28G14、03GY02②、F1、B2、95W06和31-4G02)在辣椒幼苗根茎部的定殖能力较强(定殖密度大于2.6×104cfu/g根),其中B2和F1的定殖密度为176.0和134.0,分别是致病菌辣椒疫霉(27.0×104cfu/g根)的6.5倍和5.0倍;这6株拮抗菌均具有较高的相对防效(81.2%~100%),不能定殖的菌株相对防效低(0~37.9%),说明抑菌圈-定殖力双重测定法是筛选具有双重功能生防菌的一种有效而简便的方法;6株有效菌在灭菌和未灭菌土壤中的相对平均防效分别为93.3%和87.0%;拮抗菌的相对防效与接种时间有关,有效菌株数按十叶期(44株)>开花期(38株)>结椒期(36株)的顺序排列。     

人参病原菌拮抗细菌的分离筛选与鉴定

为明确土壤拮抗细菌对人参常见病原菌的生防价值,从吉林省抚松县人参根际土壤中分离、纯化获得113株细菌,采用平板对峙法测定菌株的拮抗能力,通过温室盆栽试验研究其在土壤及人参根部的定殖规律,并通过形态、培养特征及16S r DNA序列分析进行分类鉴定。对峙试验结果表明,2株细菌对供试人参病原菌具有良好的拮抗广谱性,且多次验证其抑菌效果稳定。定殖研究结果表明,活性菌株SZ-56与SZ-60的定殖能力均达到显著水平,在土壤中的最大定殖菌量分别为每克土7.51×106CFU和7.28×106CFU,30 d后定殖菌量仍保持在105CFU;21 d后在人参根部的定殖菌量仍保持在每克根105CFU水平。根据形态、培养特征、生理生化指标和16S r DNA序列分析,确定SZ-56为内生芽胞杆菌Bacillus endophyticus,SZ-60为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。     

青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析

 利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。作者通过分离筛选自然弱毒株、⁶⁰Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得3、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。经盆栽番茄苗致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变菌株FJAT1458的防治效果最好,防效达100%。该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小。本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果。     

生防菌B1619在番茄根部的定殖及对根际微生态的影响

采用植物MS平板定殖研究法、盆栽试验和土壤酶活性检测技术研究了生防菌B1619在番茄根部的定殖规律,并评估了B1619对番茄根围土壤微生物和酶活性的影响。结果显示,生防菌株B1619在番茄根部定殖能力较强,在MS平板中,定殖量可达10⁸ CFU/g根以上。在盆栽试验中,常规土壤中或在接种青枯菌后,番茄根部生防菌的数量都呈现先下降后上升趋势,最后趋于稳定;在第15天时,定殖量达到10⁶ CFU/g根。番茄定植后,B1619对根围土壤中真菌和放线菌具有促进作用,而对细菌则表现为先促进后抑制作用。此外,B1619能够提高土壤蔗糖酶活性而抑制土壤脲酶的活性,B1619施用后第15天,蔗糖酶活性达226.3 mg/g土,比对照高88 mg/g土;土壤脲酶活性则与对照组截然相反,呈下降趋势。     

青枯雷尔氏菌Tn5转座子无致病力突变株在番茄根部的定殖特性

为筛选防治番茄青枯病的优良生防菌株,本研究以弱化指数、胞外多糖含量和盆栽苗番茄发病率为指标确定20株经形态初步判定为无致病力的青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum Tn5突变菌株的致病性,测定其在番茄根部的定殖数量,并于显微镜下观察其定殖特性。结果表明,供试的20株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的弱化指数均大于0.75,胞外多糖含量介于1.59~16.68 μg/mL之间,显著低于强致病力菌株FJAT-91,接种40 d番茄植株未出现青枯病症状;20株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株均能在番茄根部定殖,定殖数量呈先上升后下降的趋势,其中菌株T659的定殖数量最大,定殖时间最长,分别为2.86×10⁶CFU/g和35 d;透射电镜观察发现,青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株T659从番茄植株根部表皮细胞中侵入,然后进入维管束厚壁细胞,并在维管束细胞中大量繁殖和定殖,但未引起番茄根部细胞结构病理变化。表明供试的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株T659的定殖能力最强,具有良好的生防潜力。     

生防菌EN5的定殖能力及其对根际土壤微生物类群的影响

［目的］ 明确生防菌EN5菌株在番茄根、茎及根际土壤中和在黄瓜、烟草体内的定殖情况,及对根际土壤微生态的影响,为细菌性青枯病的生态治理提供理论依据。［方法］ 采用抗生素抗性标记法测定生防芽胞杆菌EN5的定殖能力;以平板培养及ERIC PCR法分析菌株EN5对番茄根际土壤微生物种群的影响。［结果］ 菌株EN5在番茄根、茎及根际土壤中均能稳定定殖,当菌株EN5处理植株15 d时,其在番茄茎内的定殖量可达5.6×104 cfu/g;此外,菌株EN5在烟草和黄瓜体内亦可定殖,其在烟草体内的定殖量较大。菌株EN5处理使根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量明显高于对照土壤,对氨化细菌、固氮菌、纤维素降解菌等微生物群体有促进作用,对反硫化细菌群体有抑制作用。同时,菌株EN5处理还改善了根际土壤中细菌群体的多样性。［结论］ 菌株EN5可以在其自然寄主番茄的根、茎及根际土壤中稳定定殖。同时,菌株EN5处理有助于改善根际土壤微生态环境,抑制病菌繁殖。     

萝卜软腐病生防菌株Hy11的筛选、鉴定及定殖特性

为探讨银杏内生细菌对萝卜软腐病的防病作用,通过块根接种和温室盆栽试验筛选对萝卜软腐菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum具有高效抑制作用的生防菌株,共获得8株拮抗作用较强的内生细菌,其中菌株Hy11抑菌作用明显.对生防菌株Hy11进行了形态观察、生理生化特性测定、16S rDNA和gyrB基因序列分析,并应用绿色荧光蛋白基因标记菌株Hy11,研究该菌株在萝卜体内的定殖动态.结果显示,该菌株对萝卜软腐病具有较好的防效,对萝卜块根和幼苗的防治效果分别为77.9％和66.7％;对萝卜幼苗的促生率达113.28％.经鉴定,菌株Hy11为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens.标记菌株Hy11-gfp在喷雾接种银杏叶片后0～3 d种群数量呈急剧下降趋势,10d后保持相对稳定;其在萝卜的根、茎和叶中均能够定殖,在根中的定殖数量最高可达1.2×104 CFU/g.     

荧光素酶标记无致病力青枯雷尔氏菌的生物学和定殖特性

为示踪青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum无致病力菌株FJAT1458在番茄植株及根际土壤中的定殖特性,采用电击法对菌株FJAT1458进行荧光素酶(luciferase,LUC)基因标记,并于室内采用生测法测定标记菌株的生物学特性、遗传稳定性、致病力及在番茄植株和根际土壤中的定殖能力。结果表明,成功将luc基因整合至无致病力菌株FJAT1458染色体上,标记菌株FJAT1458-LUC发出强烈的荧光,且PCR扩增出1 612 bp的luc基因片段;与野生型菌株FJAT1458相比,标记菌株FJAT1458-LUC的生长明显滞后,培养8h之后标记菌株FJAT1458-LUC的OD_600nm值均小于野生型菌株FJAT1458;且标记菌株FJAT1458-LUC连续传代20次后菌体浓度显著增加,发光菌体比例显著降低,LUC活性和luc基因表达量均随着传代数增加而显著降低;标记前、后菌株FJAT1458的弱化指数分别为0.90和0.89,且接种番茄植株30 d均未引起植株发病。标记菌株FJAT1458-LUC能在番茄根际土壤、根及茎中定殖,定殖数量呈...     

拮抗细菌Bs-208菌株鉴定及对几种植物病原菌的抑菌测定

从番茄田土壤中分离筛选获得的拮抗细菌Bs-208鉴定为枯草芽孢杆菌。采用不同方法测定了Bs-208菌株发酵液及分泌物滤液对番茄灰霉病菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌及棉花立枯病菌的抑菌效果。结果表明，该菌株对供试植物病原菌具有很好的抑菌效果，并可在植物叶面定殖，有效排斥和干扰植物病原等杂菌在植物叶面上的定殖，达到抑菌防病效果。     

灰葡萄孢拮抗细菌在番茄植物体表的定殖

通过耐利福平标记菌株回收，研究了灰葡萄孢拮抗细菌(地衣芽孢杆菌W10和多粘类芽孢杆菌W3、Y2—11—1)在番茄叶片和果实上的定殖能力及其影响因素。试验表明，拮抗细菌在较高浓度(10^7--10^9cfu/ml)下，定殖时间可达10—15d。接种灰霉病菌对拮抗细菌的定殖有一定影响，特别是在接种灰霉病菌1d后接种拮抗细菌和同时接种灰霉病菌与拮抗细菌的情况下，拮抗细菌的定殖能力显著下降，提示该类拮抗细菌的防病效果要好于治病效果。此外，温度较高(25—35℃)、湿度较大(RH95％一--100％)、12h光暗交替对拮抗细菌的定殖有利。     

生防细菌13-1对魔芋软腐病的控制及机理研究

生防菌13-1是溶杆菌属Lysobacter的一类极具生防潜力的新型生防细菌。本试验从拮抗作用、定殖特性、营养竞争三方面来研究其生防机理。结果表明,生防菌13-1能对不同致病力的魔芋软腐病菌Erwinia carotovora subsp. carotovora产生拮抗作用;能在魔芋根部、根际土等生态位点定殖,定殖量维持在10^3-10^6cfu/g,定殖时间长达42d,表现出良好的环境适应性和稳定性;同时该菌株与魔芋软腐病菌具有46.88%的营养物质利用相似性,具有一定的营养竞争关系。两年田间防效结果显示,在2005、2006年对照病情指数分别为38.68和61.66的情况下,生防菌13-1对魔芋细菌性软腐病的控制效果分别达到79.16%和54.91%。     

生防菌株SW11在番茄植株上的定殖能力及其对番茄灰霉病的防控效果

通过抗生素抗性标记法结合室内拮抗和小区防效试验,研究生防菌株SW11在番茄植株及其根围土壤中的定殖能力,及其对番茄灰霉病的防控效果.结果显示菌株SW11在番茄根、茎、叶和根围土壤中均能够较长时间定殖寄生,施药后5d在番茄植株内定殖量达到最高值,在根围土壤和植株表面则呈先多后少、逐渐下降的动态变化趋势,施药30 d后,菌株SW11抗Rif标记菌株在根面的存在量为1.31×104 cfu/g,根围土壤中为4.88×102 cfu/g,叶面为1.84×102 cfu/g,茎外为0.87×102 cfu/g,根、茎和叶内为20～65 cfu/g.当菌液浓度为1.57×108 cfu/mL时,施药7d后对番茄灰霉病的预防效果可达88.15％,治疗效果可达70.50％.研究结果证明生防菌株SW11可以成为番茄植株微生态环境中的有益微生物之一,能够有效控制番茄灰霉病的发生和为害,为其开发应用和番茄灰霉病的生物防治提供了理论依据和有效途径.     

拮抗内生细菌Bacillus mojavensisZA1在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土壤微生物的影响

利用GFP标记和平板分离法研究了拮抗内生细菌Bacillus mojavensisZA1在马铃薯根内及根际的定殖动态及其对土著微生物的影响。结果表明,标记菌株ZA1-gfp在土壤中定殖数量为3.7×10⁴~7.3×10⁴cfu/g;马铃薯根际为3.0×10³~1.5×10⁵cfu/g,根内为49~630cfu/g;马铃薯的根部横切面、根毛和根表皮等部位均观察到发绿色荧光的菌株ZA1-gfp菌体或聚集菌落。利用灌根法施入生防菌后,土壤中细菌、放射菌数量显著增加(P<0.05),土壤真菌数量在中期下降;土壤中细菌、真菌和放线菌的数量分别在相对稳定范围内(数据之间差异不显著)消长。该结果说明菌株ZA1-gfp能够在马铃薯根内及根际定殖且不影响土壤中土著微生物的群落稳定性。     

枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力

为探明枯草芽胞杆菌PTS-394在番茄根围的定殖能力,采用电转化法获得绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记菌株PTS-GFP,构建其生长曲线,采用对峙生长法评价其室内抑菌活性,并应用抗生素平板回收结合激光扫描共聚焦显微镜观察标记菌株在番茄根围的定殖数量。结果显示：与原始菌株PTS-394相比,标记菌株PTS-GFP的生长、对青枯病菌和4种病原真菌的室内抑菌能力无明显差异。标记菌株PTS-GFP和青枯病菌菌液单独或混合处理番茄苗,灌根当天标记菌株初始菌量接近10⁸ CFU/g,处理3 d后种群数量迅速下降,约10⁶ CFU/g,随后缓慢下降,处理10 d后种群数量约10⁴ CFU/g,处理30 d后,标记菌株仍然能被检测到,约20 CFU/g。表明枯草芽胞杆菌PTS-394在番茄根际土壤中具有一定的定殖能力。     

三个拮抗菌株对辣椒青枯病的作用机制

对辣椒青枯病菌生物防治机制的研究中发现，J2菌株(沙雷氏菌)的无抑菌能力突变株只保留了15．5％的防病效果，比野生型J2菌株的防效降低了77．6％，推测其生物防治功能主要依赖于抑菌能力。未检测出其定殖的J3菌株(假单胞菌)突变株，对青枯病的防治效果只有7．7％，比野生型J3菌株下降了90．0％，推测J3菌株主要依赖于在植株根部的定殖竞争能力。分根试验表明，BB11菌株(芽孢杆菌)的防病功能主要依赖于诱导抗性作用，亦有抑菌作用的因素。菌株J2、J3和BB11在灭菌土和自然土中均有良好的定殖表现。     

GFP标记的多粘芽孢杆菌1114在番茄根际的定殖

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株1114对多种植物病原菌具有良好的防治效果。为研究其在作物根际土壤中的迁移和定殖规律,通过电击转化引入绿色荧光标记质粒pB-SVG101,得到稳定表达的荧光标记菌株,转化后的菌株对青枯菌Ralstonia solanacearum仍保持良好的抑制效果。通过多种接种方法,发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。     

植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态及对辣椒疫病的防治效果

为了探讨具生防作用的植物内生细菌在辣椒体内的定殖动态与其防治辣椒疫病的关系,采用对峙培养法和盆栽苗防效法筛选生防菌株,依据菌体形态、生理生化性质和16SrDNA序列鉴定菌种,用抗利福平标记研究菌株在辣椒苗中的定殖动态,在同时接入植物内生细菌和灌根接种辣椒疫霉菌的条件下分析生防菌株的定殖数量与防效的关系。结果表明,菌株G9、R15和J13对辣椒疫病防效最好,经鉴定均为荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens。菌株G9和R15在辣椒根部定殖量高于菌株J13;定殖周期均在30-40d,呈“先增后减”的变化趋势;菌株G9和R15在接种第15d时定殖量最高,菌株J13在根、茎和叶中定殖量达到最高的天数分别为第9、15和15-20d,定殖数量的变化为根〉茎〉叶。菌株G9定殖量达到9．73×10^5cfu·g-1时辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约6d;菌株R15定殖量达到6．30×10^5cfu·g-1以上时对辣椒疫病的防效达到100％,保持该数量的时间约14d。研究结果展现了植物内生细菌在辣椒疫病生物防治上的应用潜力,为制定植物内生细菌防治辣椒疫病的施用技术提供了科学依据。     

植物内生细菌在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的生物防治效果

为明确植物内生细菌在棉花体内的定殖规律及对棉花黄萎病防治效果的影响,采用对峙培养法筛选对大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.抑菌活性强的植物内生细菌,通过形态及生理生化特征并结合16S r DNA和gyr B基因分析鉴定菌株;利用抗生素标记法及盆栽试验研究其在棉花体内的定殖动态及对棉花黄萎病的防治效果。结果表明:共筛选到3株对大丽轮枝菌具有强抑菌活性的菌株SZ5、DP10和CCM9,其中SZ5为蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus,定殖在棉花根部、茎部和叶部,DP10和CCM9为枯草芽胞杆菌B.subtilis,定殖在棉花根部和茎部,3株菌在棉花根部的定殖数量均在10~3CFU/g以上;棉花苗沾根分别接入3株内生细菌10 d后再接种大丽轮枝菌孢子悬浮液,对棉花黄萎病的防治效果达79.52%~89.79%,而3株内生细菌沾根接种后立即移栽到含有大丽轮枝菌的土壤中对棉花黄萎病的防治效果为23.77%~36.03%。表明不同内生细菌菌株在棉花体内的定殖规律不同;且在棉苗中定殖一定数量后,才能对棉花黄萎病产生较高的防治效果。     

枯草芽胞杆菌XF-1的根围定殖能力分析

采用抗生素标记菌株与盆栽试验研究了对大白菜根肿病具有良好防治效果的枯草芽胞杆菌XF-1的定殖动态及影响其定殖的因素,以便了解该菌株的生防机制及其商品化应用前景。结果表明,XF-1的定殖能力较强,能在大白菜根围、根表和根内长时间定殖,接种60天后,根围和根表定殖密度仍能稳定在103CFU/g土壤,根内定殖密度也仍稳定在102CFU/g根（鲜重）水平,根围和根表定殖趋势为先下降后上升再下降,最后趋于稳定;根内定殖动态则呈先上升后下降的趋势。XF-1在根部组织内的皮层薄壁细胞和导管内均有分布。定殖受土壤质量影响,灭菌土中定殖能力最强;施入菌液浓度越高,定殖菌体数越多;在16℃光照培养箱中28天后,定殖仍可达到105CFU/g土壤;施入马铃薯汁蔗糖液体培养基（PS）发酵的菌液后,XF-1在根围中的定殖量大于施入马铃薯汁葡萄糖液体培养基（PD）发酵的菌液。XF-1还能很好地在玉米根围定殖。