红托竹荪腐烂病初探

近几年红托竹荪(Dictyophora rubrovolvata)腐烂病(rot disease)发生频繁,对采集的患病样品进行显微观察和病原菌分离,并对分离出的病原菌进行了分子鉴定和致病性研究。结果表明,在患病样品组织上分离到的细菌和其它真菌,优势菌株分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌、肠杆菌属(Enterobacter sp.)细菌和伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)细菌,并非致病菌,回接试验检测无致病性,初步推断出该病害不是由细菌或真菌侵染引起的。     

广西珍珠李叶枯病病原鉴定

为了明确近年来广西壮族自治区天峨县发生严重的珍珠李叶枯病病原,采集天峨县珍珠李病叶,对病原进行分离和鉴定。本研究从病叶中分离到2种真菌,核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析表明2种真菌分离物分别与GenBank中胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和拟盘多毛孢菌Pestalotiopsis sp.具有99%的相似性。离体致病性测定结果表明,分离菌株均能使健康叶片产生症状,并通过柯赫法则(Koch’s postulates)验证。结合真菌分离物的分离比率,将广西天峨县珍珠李叶枯病病原初步鉴定为胶孢炭疽菌。     

甜瓜细菌性软腐病病原鉴定

近年来,浙江义乌等地的甜瓜(CucumismeloL.)果实上普遍发生一种外观褐色小斑,果肉水渍状腐烂现象,局部田块发病率高,损失严重。为确定病原,从病果上分离到4个细菌菌株,分别定名为M1、M2、M3和M4。烟草过敏性反应和致病性测定表明M2和M4不具致病性,而M1和M3在烟草上能引起典型的过敏性坏死反应,接种甜瓜24h内即导致果实的明显腐烂,所引起的腐烂症状与田间发病果实一致。对M1和M3进行培养性状、革兰氏染色、形态学和鞭毛观察、马铃薯薯块腐烂试验,以及16SrRNA基因测序和比较,结果证明该病害是由软腐欧氏杆菌软腐亚种Erwiniacarotovorasubsp.carotovora引起。     

8种常见芽菜致病微生物的分离鉴定

对目前产业化程度较高的黄豆、黑豆、豇豆、萝卜、蕹菜、花生、黄秋葵、向日葵等8种芽菜患病植株上的致病微生物进行分离、纯化,共得到24株细菌菌株和8株真菌菌株;利用真菌ITS和细菌16Sr DNA通用引物,分别对分离得到的细菌和真菌基因组进行分子生物学鉴定。结果表明:24株细菌分属8个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、短稳杆菌属(Empedobacter)、戴尔福特菌属(Delftia)、从毛单孢菌属(Comamonas);24株细菌均为革兰氏阴性菌,除果胶杆菌属外,其余都不是典型的植物病原菌;其中不动杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属和假单胞菌属的细菌出现在2种或2种以上芽菜上;另外4个属的细菌则只出现在1种芽菜上,呈现出寄主的专化性。8株真菌分属3个属,分别为镰刀菌属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)和根霉属(Rhizopus);其中根霉属和链格孢属的真菌分别只出现在萝卜芽菜和蕹菜芽菜上,其他6种芽菜上分离得到的真菌菌株均属于镰刀菌属。分离菌株回接试验结果表明,所有菌株均能对芽菜造成不同程度的腐烂症状,生产过程中环境微生物污染同样能致芽菜腐烂病发生。     

胡萝卜镰刀菌根腐病病原菌的鉴定

为明确内蒙古西部地区一种新病害——胡萝卜镰刀菌根腐病病原菌种类,采用组织分离法对病原菌进行分离,用胡萝卜片接种、有伤口和无伤口胡萝卜肉质根接种及盆栽接种进行致病性测定,并通过形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。结果表明,分离到的3个菌株F1、F2和F3均表现致病性。经形态学鉴定,F1菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),F2和F3为茄病镰刀菌(Fusarium solani)。进一步采用真菌通用引物ITS1/ITS4对病原菌r DNA-ITS进行PCR扩增,并将测序结果在Gen Bank中进行同源性比对分析,鉴定结果和形态学鉴定的结果一致。明确了内蒙古西部地区胡萝卜镰刀菌根腐病的病原菌种类为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄病镰刀菌(F.solani)。     

大理州“红阳”猕猴桃真菌性枝干的发生与病原鉴定

以大理州"红阳"猕猴桃枝干为试材,采用田间调查法调查病原菌对其危害状况,对采集的10份病样采用常规组织分离法分离病原,单孢纯化法获得病原菌,采用形态和分子法鉴定病原种类,以期明确大理州"红阳"猕猴桃枝干病害的发生状况及危害病原。结果表明:大理州"红阳"猕猴桃枝干病害发生严重,病株率高达69.6%,5个采样点共分离得到15个菌株,其中以链格孢菌(Alternaria alternata)、厚坦镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)、小新壳梭孢菌(Neofusicoccum parvum)和间座壳属中一种(Diaporthe bohemiae)共4类病原菌出现频率最高,是优势种,分离率分别为55.6%、52.4%、49.8%和50.1%。利用柯赫氏法则对分离所得的所有菌株进行致病性测定,证实了优势菌株对猕猴桃茎杆的致病性,进一步明确了引起大理州猕猴桃茎杆的病原真菌。     

李褐腐病病原菌的分离和鉴定

从入境李果实(Prunus domestica)上分离到一株丛梗孢属(Monilinia sp.)真菌。综合致病性测定、形态特征和分子生物学鉴定结果,确定引起李褐腐病的病原菌是美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola(Winter)Honey]。     

库尔勒香梨果萼黑斑病病原鉴定及其ITS、GPD和EF-1α序列分析

采用常规组织分离法对库尔勒香梨果萼黑斑病病样进行病原菌分离,依据科赫氏法则进行病原菌田间致病性测定,并利用分子生物学手段结合形态学鉴定确定病原菌及其分类学地位。田间致病性测定结果表明链格孢属菌株为致病菌株,利用真菌通用引物进行致病菌株保守基因(ITS、GPD和EF-1α)PCR扩增及测序,获得序列Gen Bank数据库登录号为KU145269、KU145271、KU145273。根据田间致病性、形态学观察以及保守基因遗传进化分析结果确定库尔勒香梨果萼黑斑病病原为链格孢属链格孢(Alternaria alternata)。     

黄花倒水莲内生真菌多样性及抑菌活性分析

以桂林市灵川县的黄花倒水莲为试材,采用组织块分离法、ITS测序和平板对峙等方法,研究了黄花倒水莲内生真菌的菌群组成及抗菌活性,以期为开发生防菌提供参考依据。结果表明：从黄花倒水莲中共分离得到62株内生真菌,经分子鉴定属于29个属,优势属为刺盘孢属(Colletotrichum sp.)、间座壳属(Diaporthe sp.)、镰孢菌属(Fusarium sp.)和拟茎点霉属(Phomopsis)。筛选到10株对香蕉黑条叶斑病病菌、柑橘树脂病病菌、叶点霉病菌具有较强抑菌活性的菌株。药用植物黄花倒水莲具有较为丰富的抑菌活性内生真菌资源,其抑菌活性值得深入研究。     

3株魔芋茎腐病病原菌的分离鉴定与致病性研究

镰刀菌引起的魔芋茎腐病是魔芋栽培过程中重要病害之一,为明确贵州省兴义市魔芋茎腐病的病原菌种类,2019年从贵州省兴义市采集魔芋茎腐病病样,采用组织分离法对病样进行分离,通过形态学鉴定方法结合基于rDNA-ITS与tef序列分析的分子鉴定方法对分离物进行鉴定,并按照柯赫氏法则进行致病性测定。结果显示,经组织分离法共获得3株镰刀菌纯培养物,经鉴定分属于2个种,分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和茄腐镰刀菌(F.solani);致病性结果表明,尖孢镰刀菌菌株xymy-8没有致病性,茄腐镰刀菌菌株xymy-7、xymy-9有致病性,且致病性有差异,其中菌株xymy-7的致病性强于菌株xymy-9的致病性。试验结果为魔芋茎腐病防控提供了理论依据。     

扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)研究刺芹侧耳细菌病原菌

为分析刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)工厂化栽培中发黄腐烂子实体的细菌组成,构建16SrDNA文库,利用限制性内切酶MspI和RsaI分别对随机克隆进行酶切筛选,并测定代表性克隆16SrDNA序列,BLAST分析结果表明刺芹侧耳子实体病状组织中存有两类菌群,分别为假单胞菌和芽孢杆菌属。同时,对刺芹侧耳子实体病状组织中的细菌进行分离培养、致病性测定、16SrDNA鉴定及BLAST分析,病原细菌与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的同源性较高,其作为引起刺芹侧耳工厂化栽培细菌性病害的病原菌在国内外尚属首次报道。     

番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与X-75菌株鉴定

采用琼脂平板扩散法筛选对番茄灰霉菌具有拮抗作用的细菌,经过对200株分离自土壤的细菌菌株进行初筛、复筛后,得到了1株具有较高拮抗活性的菌株X-75。对该菌株进行形态观察和生理生化特征分析,初步将其鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),将其16SrDNA序列与GenBank中已知标准菌株的16SrDNA序列进行比对,并用Neighbor-joining方法构建X-75菌株进化树,结果表明,X-75与标准菌株AB245422 Bacillus velezensis聚于同一分支,同源性最高,达99.93%;利用番茄离体叶片对X-75菌株的防效进行初步检测,结果表明X-75菌株对番茄灰霉病菌具有明显的拮抗作用。     

中国柑橘黄龙病菌16S rDNA序列研究

 运用PCR技术对来自中国7省区不同寄主上的黄龙病菌16S rDNA基因区进行了PCR-RFLP-SSCP分析, 采用3种限制性内切酶进行单酶切、双酶切及三酶切反应,对酶切产物进行了单链构象多态性（SSCP）分析,结果表明来自7省区不同寄主上9个黄龙病病菌分离物的16S rDNA无可见变异;同时对9个代表性的分离物16S rDNA进行了克隆测序,序列多重比对结果与PCR-RFLP-SSCP一致,从而在分子水平上证明了中国柑橘黄龙病病菌的16S rDNA序列高度保守, 在不同的地域、寄主内没有发现分子变异,为进一步研究柑橘黄龙病菌系统进化奠定了基础。     

2株抗枯萎病尖镰孢菌内生细菌菌株的分离及鉴定

华南地区因尖镰孢菌引起的枯萎病发生较为严重,特别是近年来发现的香蕉枯萎病,对香蕉产业来说更是毁灭性的病害。分离、筛选有拮抗活性的内生细菌是防治枯萎病的有效措施之一。从海南红树林健康叶片中分离到102株非致病性内生细菌菌株,通过室内抗菌活性的测定,得到了2株对枯萎病尖镰孢菌具有明显抑制作用的拮抗菌株。通过对它进行形态、生理生化特性及16SrDNA序列等方面的研究,确定其中1株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis,命名为BS-009;另一株确定为新发表种Bacillus Mojavensis的一个相似种,命名为BM-027。     

黄瓜根际土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析

采用PCR-DGGE技术分析了接种枯萎病菌后黄瓜根际土壤细菌群落的动态变化。对黄瓜种植前、接菌前、接菌后发病、接菌后未发病以及接种清水(对照)共5份土壤样品直接提取其总DNA,用F338-GC/R518引物扩增16Sr DNA基因的V3可变区,结合DGGE电泳条带分析样品的细菌群落组成及变化趋势。结果显示,接种枯萎病菌后,会引起黄瓜根际土壤中细菌数量及种类发生较大的变化,其中,接种枯萎病菌后Rhodococcus phenolicus(E1)、Clostridiumsp.(E3、E6)以及3种未培养细菌(E2、E4、E5)数量增加,另外2种未培养细菌(A1、A2)数量减少。     

果树内生拮抗细菌的筛选鉴定及其生防作用研究

通过组织分离法,在不同健康果树的木质部中分离到235株内生细菌。通过平板对峙法对所得菌株进行了初筛和复筛,得到6株拮抗作用较强的菌株。用过滤和高温灭菌得到的菌株发酵液进行抑菌谱试验,最终获得拮抗作用较强的内生细菌X8。对X8菌株在植物体内定殖、分类鉴定和防治作用的深入研究。结果表明：X8菌株可以在杏、辣椒等植物中定殖。X8菌株发酵液对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制作用最强,达80.3%,对3种链格孢菌（Alternaria）病原菌的抑制作用达到75%以上,对番茄灰霉病和辣椒疫病的防效达到75.4%和79.3%,显著高于50%腐霉利和25%甲霜灵的防效。经16S rDNA序列分析,X8菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的16S rDNA序列的同源性达99%。综合形态特征、生理生化特性,最终将X8鉴定为B. subtilis,在GenBank中序列登录号为HQ647257。     

西瓜枯萎病拮抗菌株的筛选与鉴定

为了从丰富的土壤微生物资源中挖掘对西瓜枯萎病有较高防效的生防菌株,通过梯度稀释和平板涂布法分离获得西瓜根际土壤主要细菌,采用平板对峙培养和测定盆栽防效的方法,从中筛选出对西瓜枯萎病有较强拮抗活性的菌株,并通过菌落形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA和gyrA基因序列比对获得生防菌株的分类地位。结果表明,从8份西瓜根际土壤中分离纯化到182个细菌单菌落,并筛选获得对西瓜枯萎病防效较高的3株拮抗细菌,接种30 d后盆栽防效均高于75%,与30%噁霉灵水剂防效无显著差异。综合形态特征、生理生化特性及序列分析结果,明确拮抗菌株JHXG0406为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),拮抗菌株JHXG0221和XQXG0111为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。获得了3株对西瓜枯萎病有较好防效的菌株,具有作为生防菌剂开发应用的潜力。     

福建省霞浦县马铃薯黑胫病菌分离及田间药剂防治效果

为明确引起福建省霞浦县马铃薯黑胫病的病原菌，从霞浦县马铃薯种植区采集马铃薯黑胫病病样分离病原菌，通过菌落形态、致病性、16S rDNA序列对病原菌进行鉴定，并进行田间药剂防治试验。序列分析和特异性检测结果表明，引起福建省霞浦县马铃薯黑胫病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum），采集的5 个菌株均有致病力，马铃薯植株被侵染后茎部出现黑腐症状，块茎组织发生浸渍。药剂防治试验结果表明：46%氢氧化铜可湿粉剂1 000倍液和2%春雷霉素水分散粒剂300倍液防效显著高于其他药剂处理，与清水对照相比，产量和商品薯率显著提高，综合防效显著。     

大花惠兰根腐病拮抗细菌ZL7-5菌株的筛选与鉴定

 从各地大花惠兰种植地采集的土样中共分离到细菌519株,初筛出对大花惠兰根腐病病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）具有拮抗活性的细菌菌株26株,经过复筛,选出1株具有较高拮抗活性的菌株ZL7-5。通过16S rDNA序列相似性分析,菌株ZL7-5与解淀粉芽孢杆菌标准菌株(NBRC 15535)的16S rDNA序列相似度达100%,通过比较菌株ZL7-5和模式菌株的形态特征和生理生化特性,最终将菌株ZL7-5鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。     

白菜黑斑病菌拮抗细菌LBC-1菌株的分离与鉴定

从湖南、湖北、河北等地区菜地采集土样，采用抑菌圈法筛选对白菜黑斑病病原菌芸薹链格孢菌（Alternaria brassicae）具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株。通过初筛得到具有拮抗作用的菌株20株，复筛出1株拮抗活性较高的菌株LBC-1。通过生理生化试验、形态特征观察及16S rDNA序列分析对其进行了种属鉴定。鉴定结果为菌株LBC-1属于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），是1株广谱拮抗芽孢细菌菌株。