鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白(H+/myoinositol transporter,HMIT)基因的转录序列,并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况,以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物,采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列,采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性,利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况,并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明,以NCBI预测的鸡HMIT(XM_001232939.5)序列为模板设计引物,成功克隆出鸡HMIT基因(1 694 bp,GenBank登录号:MN708211)。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp,相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp,预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现,鸡HMIT在物种间高度同源,共线性分析显示,HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质,其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示,鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,鸡HMIT蛋白分布于质膜(52.3%)、内质网(21.7%)、液泡(17.4%)、线粒体(4.3%)和高尔基体(4.3%)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高,且显著高于其他组织(P0.05)。胰岛素处理240 min后,HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组(P0.05)。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区,生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

QDPR基因克隆及其在乌蒙凤鸡不同生长阶段组织表达研究

旨在克隆乌蒙凤鸡醌型二氢生物喋呤还原酶（quinoid dihydropteridine reductase，QDPR）基因，并检测其在不同性别乌蒙凤鸡不同生长阶段各组织中的表达差异，以研究QDPR基因在乌蒙凤鸡生长发育过程中的调控作用。本试验对乌蒙凤鸡QDPR基因CDS区进行PCR扩增和克隆，并对得到的序列进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR检测QDPR基因在4、12、20和28周龄乌蒙凤鸡公鸡及母鸡的心、肝、脾、肺、肾、胸肌和腿肌组织中的相对表达量。结果表明，QDPR基因开放阅读框长度为417 bp，共编码139个氨基酸，编码蛋白为酸性不稳定蛋白，乌蒙凤鸡的QDPR基因序列与原鸡、日本鹌鹑和珠鸡的QDPR基因同源性较高；QDPR基因在不同性别乌蒙凤鸡不同生长阶段各组织中均有表达，其中，公鸡4、12和20周龄肺组织中QDPR基因表达量最高，极显著高于同一周龄其他组织（P<0.01），母鸡4周龄肝、脾、肺中QDPR基因相对表达量为所有时期最高，极显著高于12、20周龄（P<0.01），公鸡大多数组织中QDPR基因表达量随时间增长总体呈现出先升后降的趋势，母鸡为先降后升。结果显示，QDPR基因在乌蒙凤鸡内脏组织中的表达均高于肌肉组织，且公母鸡不同时期表达情况有所差异，试验结果可为进一步研究QDPR基因在鸡生长发育中的调控作用提供参考。     

多浪羊CNP基因克隆及其在初情期组织表达特性分析

【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。     

昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

新西兰白兔MSTN基因克隆、生物信息学分析及表达谱构建

肌肉生长抑制素（MSTN）是骨骼肌发育的主要调控因子，为获得新西兰白兔MSTN基因序列及其表达规律，试验通过RT-PCR技术从新西兰白兔腿肌组织中扩增并克隆得到MSTN基因序列，利用在线网站对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在新西兰白兔同一时期不同组织及不同时期腿肌组织中的表达量。结果显示，新西兰白兔MSTN基因CDS区序列长1 128 bp，编码375个氨基酸，其核苷酸序列与GenBank上公布的人、猪、马、小鼠、犬、牛和鸡的核苷酸序列相似性分别为95.9%、94.9%、94.9%、91.7%、91.5%、91.3%及84.2%。新西兰白兔MSTN蛋白属于酸性、亲水性分泌蛋白，且具有不稳定性，不含跨膜结构，含有1个信号肽，主要分布在内质网和线粒体中。MSTN蛋白二级结构和三级结构预测结果一致，以无规则卷曲为主，其次是α-螺旋、延伸链，为混合型蛋白。蛋白质互作关系预测发现，MSTN蛋白与PAX7、MYOG、IGF1、FST、Smad3及Smad2等与肌肉生长发育有关的蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析结果表明，新西兰白兔MSTN基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、子宫和胃中均有表达，在腿肌中表达量最高，极显著高于其他组织（P<0.01），其次是肾脏，在肝脏中的表达量最低。不同时期腿肌组织中的表达量分析结果显示，新西兰白兔MSTN基因在180日龄腿肌组织中的表达量显著高于90和240日龄（P<0.05）。研究结果为深入探讨MSTN基因对家兔肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。     

延边牛PPARγ基因的克隆及生物信息学分析

研究旨在克隆和分析延边牛过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,并探讨其在延边牛不同组织中的表达规律。参考GenBank数据库中牛PPARγ的序列（登录号：NM_181024.2）设计引物,以18月龄延边牛为试验对象,利用RT-PCR克隆得到延边牛PPARγ基因,利用NCBI中的BLAST程序与其他物种进行相似性分析并构建系统进化树;用生物信息学软件分析其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构等;用实时荧光定量PCR检测延边牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、皮下脂肪、肌肉8个组织中PPARγ基因的相对表达水平。结果显示,延边牛PPARγ基因CDS区序列为1 620 bp,相似性比对和系统进化树结果显示,与黄牛的亲缘关系最近,相似性为99.9%,与鸡的亲缘关系最远,相似性为82.1%;该基因编码505个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,主要分布在细胞核和细胞质中;延边牛PPARγ蛋白二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,存在53个潜在的磷酸化位点,24个O-糖基化位点;实时荧光定量PCR结果显示,延边牛PPARγ基因在脾脏、皮下脂肪、肝脏中表达量显著高于心脏（P<0.05）,肺脏、肾脏、肌肉和小肠中表达量显著低于心脏（P<0.05）。以上试验结果可为进一步研究PPARγ基因的功能提供借鉴。     

牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的克隆及其在各组织和不同生长阶段肝中的差异表达分析

旨在克隆牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4和5（insulin-like growth factor binding protein 4 and 5,IGFBP4 and IGFBP5）基因,并检测其在牦牛不同组织及不同生长阶段肝中的表达水平。本研究选取1日龄、15月龄和5岁龄健康雌性麦洼牦牛共9头（每组各3头）,体重分别约为（12.35±1.85）、（98.88±2.50）和（268.55±27.82） kg,采集5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾、小肠组织及3个不同生长阶段牦牛肝组织。本试验克隆IGFBP4和IGFBP5基因,并对其序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法、Western blot技术与免疫组化技术检测其在5岁龄牦牛6种组织及1日龄、15月龄和5岁龄3个不同生长阶段肝中的表达差异。结果表明,获得牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的CDS序列分别为777和816 bp,分别编码258和271个氨基酸,GenBank序列号分别为MT012934和MT003005。在同源性比较中,牦牛IGFBP4和IGFBP5序列均与黄牛的同源性最高,分别为99.6%、99.5%。组织表达谱分析显示,IGFBP4和IGFBP5基因均在5岁龄牦牛肝中表达量最高,与肾、心、小肠、脾、肺相比差异极显著（P<0.01）,且6种组织中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因（P<0.01）。不同生长阶段肝中差异表达结果显示,随着年龄的增长,IGFBP4和IGFBP5的mRNA与蛋白水平在牦牛肝脏组织中的表达量均呈现上升趋势,即5岁龄>15月龄>1日龄,在5岁龄时表达量最高,与1日龄和15月龄均存在极显著差异（P<0.01）,且IGFBP4的表达量极显著高于IGFBP5（P<0.01）。结果提示,IGFBP4和IGFBP5可能协同调控牦牛肝的生长发育,这为深入研究IGFBP4和IGFBP5在牦牛肝生长发育过程中的作用以及表达调控提供了一定的基础数据。     

豫西脂尾羊INSIG1基因克隆、序列分析及组织表达

胰岛素诱导基因1（INSIG1）是脂质合成与分解的重要调控基因，为了研究豫西脂尾羊INSIG1基因序列特征及其组织表达规律，试验采用Trizol法提取组织样RNA，RT-PCR扩增后克隆得到INSIG1基因序列并进行分析；采用实时荧光定量PCR法检测INSIG1 mRNA表达情况，并对结果进行比较分析。试验成功克隆了豫西脂尾羊INSIG1基因，其编码区长831 bp，编码276个氨基酸；基因的同源性分析表明，豫西脂尾羊INSIG1基因编码区与绵羊（XM_015095466.2）的亲缘关系相似性达99.64%，编码氨基酸序列的相似性达99.28%；蛋白理化性质分析表明，其分子质量为29.58 ku，理论等电点（pI）为9.07，属于稳定的碱性疏水性蛋白；跨膜结构、信号肽和亚细胞定位分析表明，该蛋白包含5个跨膜结构，没有信号肽，主要分布在细胞质；蛋白质三级结构预测发现，INSIG1蛋白结构含有6个α-螺旋和部分无规则卷曲；实时荧光定量PCR结果表明，INSIG1基因在肝脏中表达量最高，其次为肺脏、小肠和尾脂，肌肉中表达量最低。本研究完善了豫西脂尾羊的数据库，为INSIG1基因的功能及其在肉羊脂肪沉积过程中的作用机制提供了依据。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

鸡Apob基因组织表达与CRISPR/Cas9敲除系统的构建

旨在探究Apob基因在鸡肝脂质代谢过程中的功能。本研究对鸡Apob蛋白进行理化性质分析；利用RT-qPCR检测Apob基因在4周龄黄羽肉鸡组织中的表达情况，每组设置3个重复，进行3次平行试验。根据鸡Apob蛋白关键结构域，在Apob基因外显子设计3对sgRNA，构建Cas/gRNA载体；将重组质粒转染DF-1细胞后，利用T7核酸内切酶I （T7 endonuclease I，T7EI）酶切法和TA克隆测序法筛选敲除活性位点并计算敲除效率。利用RT-qPCR检测基因敲除后亚克隆细胞中Apob基因mRNA表达情况。结果表明，鸡Apob的相对分子质量为523.356 ku，平均亲水性为-0.300，为稳定的蛋白质，并且该基因主要在鸡的肝、肾和小肠组织表达。敲除载体转染至DF-1细胞后，T7EI酶切发现，Cas/gRNA6、Cas/gRNA7和Cas/gRNA8三个位点均可发挥敲除活性，TA克隆测序结果表明，三者的敲除效率分别为33.3%、65%和80%。同时，RT-qPCR结果显示，转染Cas9/gRNA7、Cas9/gRNA6、Cas9/gRNA8的细胞中Apob基因mRNA表达水平约分别下调99.96%（P<0.01）、85%（P<0.01）、47%（P<0.05）。综上所述，本研究揭示了鸡Apob基因在组织中的表达特点和蛋白的理化性质；成功构建了鸡Apob基因CRISPR/Cas9敲除载体，并筛选出最佳敲除位点，获得了Apob基因敲除的亚克隆细胞，为进一步探索Apob基因在鸡肝中的功能奠定了基础。     

鸡Smad4基因克隆、生物信息学及组织表达分析

试验旨在克隆鸡Smad4基因，并对其进行生物信息学和组织表达分析。以苏禽3号优质黄羽肉鸡为试验对象，使用RACE技术扩增并克隆了鸡Smad4基因全长序列，对其进行生物信息学分析，构建系统进化树，并利用实时荧光定量PCR检测了Smad4基因在鸡各组织中的表达情况。结果显示，鸡Smad4基因全长序列包含17 bp的5'UTR、1 842 bp的开放阅读框和466 bp的3'UTR，有11个外显子和10个内含子，mRNA序列全长2 325 bp，可编码613个氨基酸。系统进化树显示，鸡Smad4与其他鸟类聚为一类。生物信息学分析显示，Smad4蛋白分子质量为65.43 ku，理论等电点为10.04，为亲水蛋白；含有2个保守结构域：MH1和MH2；二级结构由α-螺旋（18.11%）、延伸链（17.29%）和无规则卷曲（64.60%）组成。组织表达分析表明，Smad4基因在鸡的心脏、肝脏、空肠、卵巢中均有较高表达，而在胸肌中不表达。本试验成功获得了鸡Smad4基因全长序列，并初步研究了其组织表达规律，为进一步研究Smad4基因在鸡繁殖活动中的分子机制提供了理论依据。     

绵羊PDGFD基因克隆及其在不同部位脂肪组织中的表达

试验旨在获得绵羊血小板源性生长因子D （PDGFD）基因的编码区（coding sequence，CDS）全长序列，并了解其在体内不同部位脂肪组织中的表达规律。以阿勒泰母羊和中国美利奴母羊为研究对象，克隆获得了PDGFD基因CDS区全长序列并对其进行了生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR方法对PDGFD基因在2个品种羊沉积在尾部、肠系膜、背部和肾脏周围4个不同部位脂肪组织中的表达水平进行定量分析。结果显示，绵羊PDGFD基因CDS区序列长度为1 113 bp，编码370个氨基酸；PDGFD基因CDS区序列及其编码序列与山羊的相似性最高，其次是牛、猪、马、人，与鼠的相似性最低，系统进化树分析结果与其一致；预测PDGFD蛋白属于稳定的亲水性蛋白，且无跨膜区，存在信号肽序列，属于分泌型蛋白；PDGFD蛋白含有1个糖基化位点、1个CUB结构域和1个PDGF结构域，PDGFD蛋白二级结构由α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲构成，三级结构与结构域和二级结构分析结果基本吻合。实时荧光定量PCR结果显示，PDGFD基因在阿勒泰羊4个脂肪组织的表达量均高于中国美利奴羊，其中阿勒泰羊尾脂和背部脂肪的表达量显著高于中国美利奴羊（P<0.05）。本研究结果为进一步探究PDGFD基因在绵羊脂肪沉积中的作用机制提供参考。     

雪山草鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)基因克隆、结构特性分析及其表达特征研究

旨在克隆血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）基因,分析其结构特性和表达特征。本试验以45和90日龄的健康雪山草鸡为研究对象,利用PCR技术扩增ACE2基因的编码区序列;运用生物信息学方法对其结构特征进行分析;通过TA克隆构建黄羽肉鸡ACE2编码区序列质粒标准品,使用绝对定量方法测定ACE2基因在45和90日龄雪山草鸡公母鸡各组织中的表达特性。结果,克隆得到2 427 bp的编码区序列,共编码808个氨基酸,与白羽肉鸡一致,但是在黄羽肉鸡序列中存在大量突变位点造成编码氨基酸发生变化。同源性比较发现,其与红色原鸡的同源性为99%,其次为绿头鸭88%,与其它动物的同源性为73%~76%。生物信息学分析发现,ACE2属于I型跨膜蛋白,即分泌型蛋白,信号肽位于1~17 aa,含有46个蛋白质磷酸化位点。定量结果发现,小肠中ACE2表达量显著高于其它组织。法氏囊、气管、胆囊和脾中ACE2表达量较低,脾中表达量最低。母鸡空肠、盲肠、脾和肺中ACE2基因表达量显著高于公鸡。公鸡肾和心中ACE2基因表达量显著高于母鸡。90日龄雪山草鸡的十二指肠、空肠、肺、脾和回肠组织ACE2基因表达量均显著低于45日龄雪山草鸡,在法氏囊和肾组织中结果呈相反趋势。通过克隆获得了雪山草鸡ACE2基因编码区序列,生物信息学分析发现,雪山草鸡ACE2基因在家禽中较为保守;ACE2基因表达规律呈现出在雪山草鸡肠道组织中高于其他组织,母鸡中高于公鸡,随着时间表达水平呈下降趋势。研究结果为开展ACE2基因在黄羽肉鸡肠道中的功能研究奠定了理论基础。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

猪TRIM3基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3（tripartite motif-containing 3,TRIM3）基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆,菌液PCR鉴定后测序,与不同物种TRIM3基因序列比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测TRIM3基因在大白猪不同组织中的相对表达量。【结果】大白猪TRIM3基因CDS序列全长2 235 bp,编码744个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,大白猪与野猪的相似性最高,达99.7%,与鸭的相似性最低,为75.1%;大白猪TRIM3基因与野猪先聚为一类,与牛和山羊亲缘关系较近。生物信息学分析显示,大白猪TRIM3蛋白分子质量为80.58 ku,理论等电点（pI）为8.32,不稳定系数为40.85,为亲水性蛋白,但不是分泌蛋白,无糖基化位点,预测其有60个磷酸化位点,主要存在于细胞质内;在TRIM3蛋白二级结构中以无规则卷曲为主,占41.67%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。组织表达分析表明,大白猪TRIM3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、气管、结肠中均有分布,肺脏中表达量最多且显著高于其他组织（P＜0.05）。【结论】本研究成功克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,并进行了生物信息学和组织表达分析,为进一步研究大白猪TRIM3蛋白的免疫学功能提供理论依据,对探究大白猪TRIM3基因参与先天性免疫和抗病毒感染分子机制具有重要意义。     

水牛PNPLA8基因编码区克隆、表达分析及催乳素对该基因的调节作用

为了探究磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatin-like phospholipase domain containing 8,PNPLA8）在水牛乳腺脂质代谢中的作用,试验根据GenBank中公布的奶牛PNPLA8基因序列（登录号：XM_005205444.4）设计引物,应用PCR扩增并克隆水牛PNPLA8基因编码区（CDS）,应用生物信息学软件分析序列及蛋白质结构;抽提水牛不同组织及不同泌乳期乳腺组织RNA,利用实时荧光定量PCR检测PNPLA8基因在不同组织间和不同泌乳期的表达;利用不同浓度的催乳素处理水牛乳腺上皮细胞,通过定量检测催乳素对PNPLA8基因表达的影响。结果显示,水牛PNPLA8基因CDS长2 355 bp,编码784个氨基酸,与牦牛、山羊等PNPLA8基因具有较高的同源性;PNPLA8基因在所检测的水牛11个组织中有不同水平的表达,在肺脏和乳腺中表达量相对较高,在脂肪和肌肉组织中表达量较低;在整个泌乳期内PNPLA8基因的表达呈现"低-高-低"趋势;催乳素处理水牛乳腺上皮细胞结果显示,随着催乳素浓度升高,PNPLA8基因表达量逐渐下降。本研究成功克隆了水牛PNPLA8基因,并发现PNPLA8基因是参与乳腺泌乳的一个功能基因,为进一步研究PNPLA8基因在水牛乳腺中的功能奠定基础。     

兔NLRC3基因克隆及其表达特性研究

本研究旨在探究兔NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptor family CARD domain containing 3，NLRC3）基因序列、分子结构和体内外表达特性。根据GenBank中公布的预测序列（登录号：XM_017338739.1）设计引物，PCR扩增并克隆兔NLRC3基因，利用生物信息学方法对其分子结构进行预测分析。构建真核表达载体pcDNA3.1-rNLRC3-HA，通过间接免疫荧光试验探究兔NLRC3的亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR检测NLRC3基因在兔各组织中的分布情况及肠出血性大肠杆菌感染后表达水平的变化。结果表明，兔NLRC3基因编码区长3 192 bp，相似性比对及系统进化树显示，兔NLRC3与其他哺乳动物相似性较高，并在进化树中处于同一分支。兔NLRC3由N-端、NACHT及LRR结构域组成，三级结构模型呈单曲率马蹄形，凸面由α-螺旋组成，凹面由β-折叠组成。间接免疫荧光试验结果显示，兔NLRC3位于细胞浆中，且不与线粒体共定位。兔NLRC3基因在所有被检组织中均有表达，且在脾脏中的表达量最高，其次是肠系膜淋巴结、淋巴滤泡。肠出血性大肠杆菌感染机体后，在脾脏、肝脏、肾脏中兔NLRC3基因mRNA表达量均上调，表明兔NLRC3基因参与了肠出血性大肠杆菌感染后的免疫应答。综上，本研究成功克隆了兔NLRC3基因并进行了生物信息学分析，明确其为胞内受体，在各组织中广泛分布，并参与了细菌感染后的免疫应答，为进一步探究兔NLRC3在炎症反应中的调控机制提供了基础材料。     

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN（vertebrae development homolog）基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1（NR6A1）、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2（PROX2）和富亮氨酸重复序列74亚基（LRRC74A）等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异（P>0.05）,但纯合突变型（ins/ins）个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。