绵羊c-Myc与EGFP融合蛋白的真核表达及其对细胞增殖的调控作用

为了探讨c-Myc基因对细胞增殖及相关基因表达的调控作用,本试验构建了c-Myc-(G_4S)_3-EGFP融合基因的真核表达载体pc-Myc-EGFP,并利用生物信息学分析了其结构和理化特征。转染后分别通过细胞计数和qRT-PCR检测了其对绵羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblasts, SEF)增殖及相关基因表达的影响,并利用启动子分析软件解析了相应的表达调控机制。酶切鉴定和测序结果表明,载体构建成功。生物信息学分析表明,绵羊c-Myc蛋白主要定位于细胞核,含有螺旋环螺旋(helix-loop-helix, HLH)结构域,其分子量为48 474.78 u。融合蛋白c-Myc-(G_4S)_3-EGFP有较强的亲水性,且含有31个磷酸化位点。因(G_4S)_3有较高的灵活度(9.848 5),两侧的c-Myc和EGFP都保持各自的空间构象且互不干扰。进一步的细胞试验结果表明,重组质粒pc-Myc-EGFP在SEF中能够表达。过表达c-Myc促进了SEF的增殖,使cyclin D2、Cdk4、Cdk6、cyclin E1、cyclin A2、cdc25A mRNA的表达水平分别升高至5.20、3.10、6.54、6.52、23.37和8.22倍(P0.01),E2F1 mRNA的表达升高至1.83倍(P0.05)。启动子分析结果表明,各基因的5′调控区存在c-Myc和E2F1的结合元件。综上所述,绵羊c-Myc通过上调细胞周期相关基因的表达促进SEF细胞增殖,c-Myc的作用机制可能是通过直接作用于靶基因5′调控区的E-box元件,也可能是通过其他转录因子(如E2F1)的间接调控作用而实现。     

H2S暴露对保育猪氧化还原状态及硫化氢代谢的影响

本试验旨在研究硫化氢（H₂S）暴露对保育猪氧化还原状态及内源性H₂S代谢的影响。试验选取12头体况健康、体重相近（（11.61±1.51） kg）的35日龄大白猪,随机分为2组并分配到2个环控舱内,公母各半,每组6头猪。试验组环控舱内H₂S浓度控制为30 mg·m^-3,对照组环控舱内H₂S浓度控制为0 mg·m^-3,试验期28 d。试验结束后采集血清和肝组织样品,检测氧化还原和H₂S代谢相关指标。结果显示,与对照组相比：1）血清中ROS含量极显著增加（P<0.01）,MDA含量显著增加（P<0.05）;抗氧化酶T-SOD活性显著降低（P<0.05）,CAT和GPX活性极显著降低（P<0.01）;非酶抗氧化物GSH和GSSG含量无显著变化（P>0.05）。2）肝中T-SOD和GPX活性极显著升高（P<0.01）,·OH清除能力显著提高（P<0.05）;ROS、H₂O₂、PC、MDA、GSH、GSSG含量无显著差异（P>0.05）。3）肝中Keap1的mRNA表达量显著下调（P<0.05）,Nrf2的mRNA表达量显著上调（P<0.05）;抗氧化相关基因（SOD2、GPX1、GPX2、GPX4和GSR）的mRNA表达量显著上调（P<0.05）。4）血清和肝中H₂S含量显著降低（P<0.05）;肝内源H₂S合成酶CSE和CBS的mRNA表达量显著下调（P<0.05）,3-MST的mRNA表达量无显著变化（P>0.05）;肝H₂S分解代谢酶SQR和SUOX的mRNA表达量下调,但差异不显著（P>0.05）。结果表明,30 mg·m^-3 H₂S暴露导致保育猪血清抗氧化系统受损,而肝中Nrf2/Keap1信号通路的激活使肝免受氧化损伤;此外,H₂S暴露抑制了保育猪内源性H₂S的合成代谢。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

BMP4调控睾丸支持细胞增殖的初步研究

旨在研究BMP4对睾丸支持细胞增殖的调控。本试验选取0、1、2和3月龄组的健康大足黑山羊公羊各3只,采集睾丸支持细胞,每次试验均设3个生物学重复和3次技术重复,通过体外培养、细胞免疫荧光、基因干扰、过表达、qPCR和Western blotting等技术对BMP4是否通过Id2对山羊睾丸支持细胞进行调控以及它们的调控关系进行验证。结果发现,BMP4在2月龄组大足黑山羊睾丸支持细胞中的表达量极显著高于0、1月龄组（P<0.01）;在一定范围内,随着BMP4浓度的增加睾丸支持细胞的增殖活性有所增强,BMP4浓度为200 ng·mL^-1时其增殖能力最强（P<0.05）;干扰BMP4后,细胞增殖活力显著下降（P<0.05）,但在72 h后回到正常水平（P>0.05）,PCNA的表达极显著降低（P<0.01）,表明干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制,细胞增殖指数测定结果进一步说明,干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制;过表达BMP4后,Id2基因表达水平极显著增加（P<0.01）,表明BMP4对Id2具有正向调控作用;相对过表达BMP4再干扰Id2试验组,干扰Id2试验组的PCNA基因的表达水平显著降低（P<0.05）,这进一步证明BMP4可以调控该基因和蛋白表达。综上所述,山羊睾丸支持细胞的增殖活力在一定范围内与BMP4的浓度呈正相关;且BMP4能够正向调控Id2的表达,并通过促进Id2的表达进而促进支持细胞的增殖。本研究为阐明BMP4调控山羊睾丸支持细胞的分子机制和生理功能提供了基础。     

5-Aza-dC对牛成肌细胞MyoD1启动子甲基化及mRNA表达的影响

旨在探究5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC）对牛成肌细胞的增殖和肌分化因子（myogenic differentiation 1,MyoD1）启动子甲基化以及mRNA表达的影响。本研究复苏了前期冻存的关岭牛成肌细胞,并进行培养,待其生长到对数生长期,再通过不同浓度的5-Aza-dC对牛成肌细胞进行处理,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期;结合高通量检测方法检测MyoD1启动子甲基化水平,并利用qRT-PCR检测MyoD1及相关基因的表达水平。研究发现,0.1 μmol·L^-15-Aza-dC为最适浓度,该浓度下细胞抗凋亡因子Bcl的表达极显著降低（P<0.01）,促凋亡因子Bax的表达极显著提高（P<0.01）,促凋亡因子Caspase-9的表达显著提高（P<0.05）;周期因子Cyclin A2的表达显著提高（P<0.05）,而细胞因子Cyclin B1、Cyclin D的表达无显著变化;检测空白组和试验组MyoD1启动子甲基化水平发现,试验组甲基化水平极显著低于空白组（P<0.01）;而mRNA的表达水平极显著高于空白组（P<0.01）。5-Aza-dC能够通过改变Caspase-9、Bcl、Bax、Cyclin A2等基因的表达来调节关岭牛成肌细胞的增殖和凋亡,并能够有效降低MyoD1基因启动子的甲基化水平（P<0.01）;极显著提高其mRNA的表达量（P<0.01）。低浓度的5-Aza-dC能通过促进细胞凋亡及调控关岭牛MyoD1的甲基化水平来调控MyoD1的表达;同时推测,MyoD1基因启动子的甲基化水平能够影响关岭牛成肌细胞的生长发育,可为遗传标记辅助关岭牛的改良提供理论参考。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

沙门菌通过NF-κB/β-catenin信号通路引致IPEC-J2损伤的分子机制

为研究沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制,试验用沙门菌刺激IPEC-J2,在特定时间收集细胞及其培养上清液,采用荧光定量PCR或ELISA检测细胞紧密连接蛋白、炎症反应相关蛋白和细胞增殖相关蛋白的表达以及乳酸脱氢酶（LDH）含量,以确定该沙门菌能够引起IPEC-J2损伤,并进一步采用NF-κB抑制剂和小干扰RNA预处理IPEC-J2,分析了NF-κB/β-catenin信号通路在沙门菌引起IPEC-J2损伤中的调控作用。结果显示,与对照组相比,沙门菌感染组紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA表达量在感染后6和24 h呈极显著下降（P<0.01）;促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的生成量以及LDH释放量在感染后6、12和24 h呈极显著上升（P<0.01）,NF-κB p65的mRNA表达在感染后1、3和6 h也呈极显著上升（P<0.01）;细胞增殖蛋白cyclin D1和c-Myc的mRNA表达在感染后6、12和24 h呈显著下降（P<0.05）,其转录调控因子β-catenin的mRNA表达在感染后24 h呈极显著下降（P<0.01）。与沙门菌感染组相比,抑制剂+沙门菌感染组ZO-1和Occludin的mRNA表达量在12和18 h呈极显著增高（P<0.01）,而NF-κB p65、TNF-α和IL-8的表达以及LDH释放量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）;siRNA-β-catenin+沙门菌处理组的β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达量在各时间点均呈极显著降低（P<0.01）,LDH释放量在6和12 h均呈极显著增加（P<0.01）,但在18 h增加不显著（P>0.05）。本试验结果表明,沙门菌激活了NF-κB信号通路,促进了促炎性细胞因子的生成,加重了细胞损伤;同时,沙门菌抑制了β-catenin信号通路,降低了细胞增殖蛋白和紧密连接蛋白的表达,影响了细胞修复,从而出现细胞损伤与细胞修复之间的失调,最终呈现出细胞损伤。本试验从NF-κB/β-catenin信号通路的角度揭示了沙门菌引致IPEC-J2损伤的分子机制。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

miR-138靶向PGC-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照（NC）组（P<0.01）,而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积（P<0.01）;RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达（P<0.01）,抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平（P<0.05）;此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调（P<0.05）,而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调（P<0.01）;抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调（P<0.05）,PGC-1α和PTPN11表达极显著上调（P<0.01）;CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）,而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度（P<0.01）。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α 3'UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。     

藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。     

猪METTL3基因表达水平与DON诱导IPEC-J2细胞损伤的关系

旨在初步探究猪m6A甲基化酶METTL3基因表达水平与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)损伤的关系.本研究构建了稳定干扰METTL3基因表达水平的IPEC-J2细胞系,用1 μg·mL-1 DON诱导METTL3干扰组和对照组猪肠上皮细胞48 h,通过实时荧光...     

Relationship Between Expression Levels of Porcine m6A Demethylases FTO and ALKBH5 Genes and Resistance to E.coli F18 Infection

To investigate the relationship between the mRNA expression level of m⁶A demethylase and E.coli F18 resistance in piglets,Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA expression differences of m⁶A demethylase FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum tissues of E.coli F18-resistant and -sensitive individuals from 35-day Sutai weaned piglets.In E.coli F18ab,F18ac bacteria-stimulated and endotoxin LPS-induced porcine small intestinal epithelial cells (IPEC-J2),the expression levels of FTO and ALKBH5 genes were detected,respectively.The results showed that the expression levels of FTO and ALKBH5 genes in the duodenum and jejunum of resistant individuals were extremely significantly or significantly higher than those of sensitive individuals (P<0.01,P<0.05),and the expression of FTO gene were not significantly changed in E.coli F18 bacteria-stimulated IPEC-J2 cells (P>0.05),but the expression levels of ALKBH5 gene were significantly up-regulated after F18ac stimulation (P<0.05).After LPS induction for 4 hours,the expression levels of FTO and ALKBH5 genes showed significant up-regulation in IPEC-J2 cells (P<0.05).This study preliminarily verified and indicated that the expression levels of m⁶A demethylases FTO and ALKBH5 genes were closely related to E.coli resistance of piglets at the cellular and individual levels,which will provide a theoretical basis for future in-depth study of the regulation mechanism of RNA demethylation modification on bacterial diarrhea in piglets.     

敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

Effect of Vitamin E on Bovine Granulosa Cells Apoptosis and Proliferation through Cx43

The aim of this study was to determine the effect of vitamin E on Cx43,the mechanism and function of vitamin E on bovine granulosa cells apoptosis and proliferation.In this study,granulosa cells were isolated from bovine ovary and cultivated in vitro by adding different concentration of vitamin E (0,25,50,100,200 and 500 μmol/L) for 24 h.After cultured,apoptotic cells were detected by FCM,mRNA expression levels of BCL2/BAX、P53 and Cx43 genes were determined by Real-time PCR and cell proliferation was detected by CCK8.The results showed that compared to control group,100 μmol/L vitamin E could significantly inhibit the apoptosis of granulosa cells (P<0.05).Real-time PCR detection results showed that vitamin E significantly changed the mRNA expression levels of BCL2/BAX,P53,Cx43 genes (P<0.05).Vitamin E could significantly improve granulosa cells proliferation when granulosa cells were treated for 24 and 36 h (P<0.05).The results provided a theoretical basis on further analysis for studing the influence mechanism of vitamin E on oocytes development and maturity,and improvement of female animal reproduction by influencing granulosa cells proliferation and apoptosis.