人工感染鸭源新城疫病毒对绍鸭β-防御素和细胞因子基因表达的影响

试验旨在探讨人工感染鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)对绍鸭β-防御素(avianβ-defensins,AvBDs)和细胞因子基因表达的影响。选用45只20日龄SPF绍鸭,随机分为攻毒组(27只)和对照组(18只),攻毒组采用滴鼻点眼的途径(108.38 EID50)接种鸭源NDV强毒株(Md/CH/LGD/1/2005),对照组接种磷酸盐缓冲液。在攻毒后24和48h,从对照组及攻毒组各随机取6只鸭屠宰,分别采集肾脏、肺脏、气管、腺胃、骨髓、脾脏、盲肠扁桃体、哈德氏腺、法氏囊9个组织,运用实时荧光定量PCR法检测组织样品中9种AvBDs和细胞因子的表达量;剩余鸭每天持续观察,每隔4d采血1次,直至24d,检测血清抗体水平;于攻毒后24、48、72和120h采集咽喉及泄殖腔拭子,以确定排毒周期。结果表明,感染该NDV毒株后,鸭没有临床发病症状和死亡情况发生;感染后鸭排毒开始于攻毒后第1天,到第5天停止,在攻毒组咽喉及泄殖腔拭子中均检测到NDV。抗体水平检测结果显示,该NDV能够诱导鸭体内产生抗NDV特异抗体。实时荧光定量PCR结果发现,与对照组相比,感染后24h,部分鸭组织中AvBD1、AvBD2、AvBD5、AvBD6、AvBD9和AvBD16表达量均显著升高(P<0.05);感染后48h,AvBD1和AvBD6在部分鸭组织中表达量均显著上调(P<0.05);感染后48h法氏囊中白细胞介素6(IL-6)和脾脏中干扰素γ(IFN-γ)的表达量明显低于感染后24h的表达量。综上所述,该鸭源NDV毒株感染可诱导绍鸭体内在早期产生天然免疫反应,这些反应可能与病毒在机体内复制有关。     

传染性支气管炎病毒对鸡免疫反应及重组禽β-防御素11和12抗病毒作用的研究

【目的】探究呼吸型传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）对蛋鸡免疫反应的影响及重组禽β-防御素（avian β-defensins,AvBDs）的抗病毒作用。【方法】试验将70只7日龄SPF白来航鸡随机分为2组,每组35只。攻毒组通过滴鼻点眼途径接种呼吸型IBV强毒（CK/CH/LSD/05I）,对照组以相同途径接种等剂量灭菌PBS。定时观察临床症状14 d并记录,在攻毒后12 h、36 h、3 d、7 d和14 d 2组各随机选取5只鸡心脏采血处死,检测血清抗体水平并收集部分气管和肾脏进行组织病理学检测。采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,提取RNA,运用实时荧光定量PCR方法检测组织中IBV的病毒载量、Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）及信号转导分子、AvBDs基因表达量变化。将重组AvBD11和AvBD12转染鸡胚肾细胞（chicken embryo kidney,CEK）并在病毒感染细胞后6、12、24、36和48 h收取细胞上清和细胞用于提取RNA,通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。【结果】感染呼吸型IBV强毒后,鸡出现轻微呼吸道症状,剖检无明显病理变化。在感染14 d后,鸡血清抗体水平转阳且阳性率为100%。实时荧光定量PCR结果显示,对照组均未检测到病毒,攻毒组仅在感染14 d后的气管中检测到病毒且病毒载量低。与对照组相比,攻毒组脾脏中TLR1、TLR5、AvBD9和AvBD12基因表达量在感染后7 d均显著升高（P<0.05）,攻毒组法氏囊中TLR1、TLR2、TLR3、AvBD5和AvBD9基因表达量及气管中核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、NF-κB c-Rel、AvBD5、AvBD9、AvBD11和AvBD13基因表达量在感染14 d后均显著升高（P<0.05）。体外抗病毒结果显示,与转染空载体组相比,转染AvBD11的CEK细胞在感染24和48 h后病毒载量显著下调（P<0.05）,细胞上清的病毒载量在感染48 h后显著下调（P<0.05）;转染AvBD12的CEK细胞在感染12和24 h后病毒载量显著下调（P<0.05）,细胞上清的病毒载量在感染12和48 h后显著下调（P<0.05）,说明重组AvBD11和AvBD12在CEK细胞中具有抗IBV活性。【结论】呼吸型IBV强毒感染机体后增强了相关受体的基因表达和信号转导,上调了AvBDs基因表达,加强了机体免疫反应。重组AvBD11和AvBD12具有抗病毒作用,为无抗饲料的配制及研究提供了新思路。     

鸭源新城疫病毒强毒株对鸭的致病性

对鸭源新城疫病毒（NDV）强毒株JSD0812对鸭的致病性进行了研究。结果显示,对于15日龄雏鸭,JSD0812株病毒尿囊液的半数致死剂量（LD50）为101mL。15,30,45,60。110日龄鸭肌肉注射感染试验结果表明,所有日龄鸭感染JSD0812株后均可发病,但死亡率随日龄的增长而下降,110日龄鸭感染后未见死亡。鸭感染后可经咽喉和/或泄殖腔短期排毒,感染鸭组织器官中病毒分离率较低。     

鸭源NDV103的生物学特性研究

鸭源新城疫（Duck Newcastle disease）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种高度接触性、急性传染病。为了对鸭源新城疫病毒进行生物学特性研究，本文选取鸭源NDV103测定其鸡胚半数感染量（EID50），脑内致病指数（ICPI），静脉致病指数（IVPI），鸡胚最小致死量平均死亡时间（MDT），分别对30只7日龄SPF鸡和30日龄SPF鸡进行攻毒实验，结果显示EID50为10-8.42/0.2 ml，MDT为58.5 h，ICPI为1.92，IVPI为1.77，该毒株对SPF鸡均有100%致死率，实验表明该毒株为强毒，且鸭源NDV对SPF鸡有致死性。     

H9N2亚型禽流感病毒对樱桃谷肉鸭的致病性

为了研究H9N2亚型禽流感病毒（AIV）对樱桃谷肉鸭的致病性。本试验利用1株鸭源H9N2亚型AIV分别通过静脉注射和鼻内接种途径感染2周龄健康樱桃谷肉鸭,观察感染鸭的症状、排毒规律及组织学变化,流式细胞术分析外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞变化规律,实时荧光定量（RT-qPCR）检测脾脏中细胞因子的表达水平,并测定血清HI抗体效价。结果显示,攻毒后,静脉注射组鸭出现体质量增长显著缓慢、呼吸道症状以及全身性感染,而鼻内接种组鸭无明显临床症状,仅发生局部感染;两攻毒组鸭泄殖腔较气管排毒量高且排毒时间长;外周血CD8^＋T细胞显著升高,并且脾脏IFNA、IFNB、IFNG和IL2表达水平上调,IL1B和IL6表达水平仅在静脉注射组上调;血清HI抗体水平低且维持时间短。结果表明,在实验室条件下,H9N2亚型AIV对樱桃谷肉鸭致病力较弱,仅静脉接种组引起鸭体质量增长缓慢及呼吸系统出血、淋巴细胞浸润。     

贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

为了科学理解家鸭在新城疫病毒(NDV)流行和传播中的作用,对贵州不同地区分离的5株鸭源NDV强毒株进行遗传变异分析以及对鸭和SPF鸡的致病性研究。结果显示:5株NDV分离株均属于基因Ⅶd亚型,其F蛋白裂解位点基序均为112 RRQKRF117,符合强毒株序列特征,与病毒致病性指数测定结果相符;F和HN蛋白中功能性氨基酸位点均高度保守,但在HN蛋白线性表位区有3株发生E347K突变。交叉血凝抑制试验发现分离株与传统疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%~87.0%),而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%~100%)。将5株NDV分离株以0.5mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射感染鸭后未见明显发病死亡和病理变化,并且除脾外在其他多个组织脏器未能检测到病毒复制;而以106.0 ELD50·0.1mL-1剂量通过滴鼻点眼感染SPF鸡后6d内100%发病死亡,病死鸡表现出新城疫典型的临床症状和病理变化,病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。另外,SPF鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭病毒分离率明显高于试验鸭。本研究结果表明,贵州省鸭群中流行的基因Ⅶd亚型NDV强毒株HN蛋白发生E347K突变的变异株呈上升趋势,并与传统疫苗株产生抗原差异;5株鸭源NDV强毒株对鸭和鸡致病性差异显著,虽然对鸭无明显致病性,但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔向体外排毒,因此必须采取有效措施防止NDV强毒由鸭群向鸡群的传播。     

鸭群感染禽副粘病毒后的排毒规律

为了了解鸭副粘病毒在鸭群排毒情况,取健康鸭25只。在15日龄时用副粘病毒经肌肉注射接种15只,另取5只不接种任何东西做空白对照,5只接种0.5ml生理盐水。24h后利用NDV强毒快速诊断试剂盒进行排毒的动态监测。结果表明试验第2天开始排毒,16天结束,其间在6～7天出现排毒高峰.空白鸭通过接触攻毒鸭也能感染并排毒。我们的试验为以后制定对副粘病毒的防疫程序起一定的指导作用。     

基因Ⅶ型新城疫强毒对樱桃谷鸭的致病性试验

用108ELD50基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)强毒对20只樱桃谷鸭和SPF鸡进行攻毒,同时分别设10只同日龄樱桃谷肉鸭和SPF鸡为空白对照,进行同居感染。试验鸭攻毒后1、4、7和14d取喉头、泄殖腔棉拭和肝、脾、肾等内脏组织进行病毒分离,同时采血进行ND抗体检测。SPF鸡攻毒后5d内100%死亡,对照组9d内100%死亡。试验鸭攻毒组和对照组在14d观察期内无明显临床症状,攻毒后第7天开始部分试验鸭喉头、泄殖腔棉拭和内脏分离到NDV,第14天试验鸭血清NDHI抗体阳性。结果表明NDV强毒感染鸭群后并不引起明显的发病、死亡,但是病毒可以在其体内复制,并通过喉头和泄殖腔排毒,具有重要的流行病学意义。     

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒（NDV）国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。     

鸭甲型肝炎病毒二价卵黄抗体(1型+3型)不同时间的治疗效果评估

将1型鸭甲型肝炎病毒RPVA1901-Z株、3型鸭甲型肝炎病毒RPVA1902-Z株分别人工感染4日龄健康易感雏鸭,在攻毒后4 h、8 h、12 h、18 h和24 h分别皮下注射鸭甲型肝炎病毒二价卵黄抗体（1型+3型）进行治疗。结果表明,攻毒后4～8 h治疗,治愈率100%,攻毒后12 h治疗,治愈率70%～80%,攻毒后18h治疗,治愈率24.9%～50%,攻毒后24 h治疗,治愈率7.7%～23.5%;攻毒对照死亡率90%～100%;健康对照组100%存活。感染后越早免疫,治疗效果越佳。     

Latency sites and reactivation of duck enteritis virus

Duck virus enteritis (DVE) is a contagious disease caused by herpesvirus in waterfowl populations. Recovered birds become carriers and shed the virus periodically. Reactivation of latent duck enteritis virus (DEV) has been implicated in outbreaks of DVE in domestic and migrating waterfowl populations. In this study, the sites for virus latency were determined in white Pekin ducks infected with the DEV-97 strain. At 3 wk postinfection, infectious virus was not detectable in tissues or cloacal swabs (CSs). At 7 and 9 weeks postinfection, the viral DNA was detected by polymerase chain reaction in the trigeminal ganglia (TG), suggesting that the virus is latent. Viral DNA was detected in the peripheral blood lymphocytes (PBL), spleen, thymus, bursa, and CSs only after in vitro cocultivation. In vivo virus reactivation was demonstrated when dexamethasone or a combination of dexamethasone and cyclophosphamide was inoculated in latently infected ducks. The reactivation of DEV occurred without any clinical evidence of the disease, but the virus was detected in PBL and CSs. We conclude from this study that DEV establishes latency in TG and lymphoid tissues including PBL.     

间接免疫荧光染色检测鸭源副黏病毒及在鸭体内的抗原定位

以抗新城疫病毒F蛋白的单克隆抗体为一抗,建立了间接免疫荧光染色法(IFA)检测石蜡切片中鸭副黏病毒(DPMV)的方法。以建立的IFA对DPMV人工感染鸭的各组织器官进行检测,结果显示:各组织器官均能检测到DPMV,但不同时间取样,阳性信号分布的器官不同。脾脏、胸腺、法氏囊、肠道、肝脏、肺脏DPMV的阳性检出率较高,表明这些器官为DPMV的主要靶器官。在所检测的阳性组织中,病毒抗原分布在细胞浆中。IFA检测石蜡切片中的DPMV具有直观、特异性强的优点,是对DPMV进行检测和抗原定位的良好方法。     

人工感染种鸭生殖系统中新城疫病毒的检测

本研究旨在探明鸭源新城疫病毒(NDV)通过人工感染后在种鸭生殖系统中分布。应用本实验室分离的一株经鸭胚传递的NDV SDFCH株,对42只无NDV感染的28周龄樱桃谷种鸭进行人工感染试验,试验分母鸭接种强毒组,公鸭接种强毒组和对照组。强毒接种4 d后,每隔2 d每组各迫杀2只,采集母鸭卵巢、卵泡、输卵管组织,公鸭采集睾丸、输精管进行病毒分离鉴定,并利用RT-PCR方法进行病毒F基因的扩增与同源性分析。同时,以NDV F蛋白的单克隆抗体(MAb)为一抗,建立间接免疫荧光检测方法检测输卵管组织中NDV及病毒在输卵管的分布情况。结果表明采用RT-PCR方法能够在种鸭生殖系统各个组织中检测并重新分离到NDV;输卵管子宫部和蛋白分泌部纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞内有阳性荧光信号存在。结果表明人工感染的种鸭卵巢、卵泡、睾丸、输精管以及输卵管子宫部和蛋白分泌部纤毛柱状上皮的纤毛细胞和分泌细胞中均有NDV分布,病毒能否随蛋白分泌、精液的排泄进入种蛋传递给雏鸭还有待于进一步研究。     

Functional analysis and induction of four novel goose (Anser cygnoides) avian β-defensins in response to salmonella enteritidis infection

In the current study, four novel avian β-defensins (AvBDs) (AvBD2, 5, 9, and 10) were identified in tissues from the Chinese goose (Anser cygnoides). The antibacterial activity of the AvBDs showed that all of these AvBDs exhibited antibacterial activity against most of the bacteria investigated (P<0.01). In addition, antibacterial activity of all of the AvBDs against Staphylococcus aureus and Pasteurella multocida decreased significantly or was completely abolished at 150mM NaCl (P<0.01). None of the AvBDs showed hemolytic activity. AvBD2 and AvBD10 were expressed widely, whereas AvBD5 and AvBD9 mRNAs were expressed in a limited number of geese tissues. AvBD9 was significantly induced in some immune tissues from geese after Salmonella enteritidis infection. The others were significantly upregulated in small intestine and some immune tissues of the geese (P<0.01). The present results suggest that the AvBDs are part of the host defense mechanism of the goose.     

Prior infection with antigenically heterologous low pathogenic avian influenza viruses interferes with the lethality of the H5 highly pathogenic strain in domestic ducks

Low and highly pathogenic avian influenza viruses (LPAIVs and HPAIVs, respectively) have been co-circulating in poultry populations in Asian, Middle Eastern, and African countries. In our avian-flu surveillance in Vietnamese domestic ducks, viral genes of LPAIV and HPAIV have been frequently detected in the same individual. To assess the influence of LPAIV on the pathogenicity of H5 HPAIV in domestic ducks, an experimental co-infection study was performed. One-week-old domestic ducks were inoculated intranasally and orally with phosphate-buffered saline (PBS) (control) or 10⁶ EID₅₀ of LPAIVs (A/duck/Vietnam/LBM678/2014 (H6N6) or A/Muscovy duck/Vietnam/LBM694/2014 (H9N2)). Seven days later, these ducks were inoculated with HPAIV (A/Muscovy duck/Vietnam/LBM808/2015 (H5N6)) in the same manner. The respective survival rates were 100% and 50% in ducks pre-infected with LBM694 or LBM678 strains and both higher than the survival of the control group (25%). The virus titers in oral/cloacal swabs of each LPAIV pre-inoculation group were significantly lower at 3–5 days post-HPAIV inoculation. Notably, almost no virus was detected in swabs from surviving individuals of the LBM678 pre-inoculation group. Antigenic cross-reactivity among the viruses was not observed in the neutralization test. These results suggest that pre-infection with LPAIV attenuates the pathogenicity of HPAIV in domestic ducks, which might be explained by innate and/or cell-mediated immunity induced by the initial infection with LPAIV.     

鸭源新城疫病毒的生物学特性

用鸡胚尿囊腔传代法从23个鸭泄殖腔拭子中分离到1株病毒，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴定为新城疫病毒。该毒株ELD50为5．85log10，鸡胚平均致死时间(MDT)为92．5h，1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)为0．5，6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)为0．3，属于中等偏弱毒力的毒株。该毒株不引起6周龄雏鸡发病。结果表明家鸭也能感染NDV。     

鸭瘟病毒强毒株在急性人工感染成年鸭病例体内分布规律

5 6只 3月龄四川麻鸭经皮下接种鸭瘟病毒 (DPV)强毒 SC1株 ,成功建立了 DPV感染的急性病理模型 ,并应用PCR方法检测了不同时间 DPV在感染鸭体各组织器官的分布情况。结果表明 ,接种 2 h后 ,即能够从脑、肝、脾、法氏囊、胸腺中检出 DPV DNA;12 h,可从心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、胸肌、食管、腺胃、血液、舌、口腔分泌物、皮肤、骨髓和粪便等检测到 DPV的 DNA。检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏和脑组织。本试验为阐明 DPV的致病机理和应用 PCR方法检测感染鸭体组织中的 DPV提供了重要的实验数据。     

应用逆转录套式PCR检测新城疫病毒核酸

选择DNV融合蛋白保守的编码区域,设计并合成了一对外引物和一对内引物,建立并优化了检测新城疫病毒核酸的逆转录套式PCRI地,通过检测NDV感染的实验客观存在病料和临床病料,结果表明,逆转录套式PCR法最低能鉴别出约0.3pg的NDV RNA,攻毒后第8天还能从非免疫鸡和SPF鸡泄殖腔拭子中检出DNV,第8天非免疫鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为5/10,第8天SPF鸡泄殖腔拭子中NDV的最大检出率为6/10,对非免疫鸡和SPF鸡的泄殖腔中NDV最佳检出时间均在攻毒后第5天。逆转录套式PCRY应运地临床样品中DNV的最大检出率为6/7,经核酸杂交验证,该法具有很高的特异性和敏感性,也比较简便快速,为从分子水平探讨NDV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

新城疫单抗ELISA试剂盒监测免疫鸡群中新城疫强毒

应用新城疫（ND）单抗ELISA试剂盒对2个免疫鸡群中ND强毒感染情况及个体感染强毒后排毒动态跟踪监测，并平等测定其HI抗体效价。共采集泄殖腔棉拭子和血液对应样品2317份。结果表明：HI效价2－14之间的个体均可检出强毒，其中HI效价在6以下和11以上的个体强毒检出率都较高。HI效价在6以上的个体仍角感染强毒，强毒感染导致HI抗体水平上升，且感染前低者上升速度较快，幅度亦较大；并且发现排毒个体的高水平抗体是强毒感染所致。个体感染强毒后排毒过程可长达3周，而且感染前抗体水平低者排毒时间相对较长。强毒一旦侵入鸡群便可在群内巡回传播，长期维持下来。