CRISPR/Cas9定点编辑水稻LOC_Os05g31750基因位点及靶修饰位点遗传稳定性研究

为明确CRISPR/Cas9系统中Cas9蛋白的持续剪切是否会导致原已突变的靶位点在水稻代际之间传递时再次产生新的突变,本研究以水稻粳稻品种台北309为转基因受体材料,通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻基因位点LOC_Os05g31750,并获得了6株靶位点敲除成功的T_0转基因突变体植株,经三代种植收获后,进一步对携带Cas9基因的T_1和T_2群体进行靶修饰位点PCR扩增测序检测。结果表明,来源于2个T_0纯合双等位突变体T_0-8和T_0-12的所有测试后代群体的靶修饰位点序列都与对应的T_0突变体保持一致,进一步证明CRISPR/Cas9基因编辑水稻的靶修饰位点在代际之间可以稳定遗传。本研究结果为利用CRISPR/Cas9基因编辑突变体的遗传后代进行基因功能丧失后的表型分析提供了参考依据。     

CRISPR/Cas9系统构建的水稻OsPht基因突变体材料可用于养分转运评价

【目的】CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为免受外来DNA片段侵袭形成的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas9已经被作为一种基因编辑的工具广泛应用到很多动物和植物的基因编辑。磷元素是植物生长过程中必需的营养元素,植物对磷的吸收主要由跨膜磷转运蛋白完成。本研究利用CRISPR/Cas9技术对Oryza Japonica Kitaake水稻中冰叶日中花磷转运蛋白McPht基因的同源体OsPht磷转运蛋白基因进行编辑,构建了McPht转运蛋白基因导入水稻OsPht缺失的突变体,初步验证了该突变体材料的功能。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑手段,将水稻中与McPht蛋白同源性最高的磷转运蛋白基因进行编辑。首先将待编辑的基因片段连接到U3启动子驱动的pCXUN表达载体上,转化到农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌转化到水稻幼胚,将获得的转化后再生T0代株系移栽到田间获得T1代种子,并将T1代株系进行盆栽培养,提取株系叶片基因组DNA用于PCR检测,所有株系PCR产物纯化后进行测序,依据序列变化判定目标基因的编辑位点,并对突变体进行生理指标测定。【结果】1) 基因编辑后的类型可分为两类,一类为目标编辑片段20个碱基中后6个碱基缺失,另一类为目标编辑片段20个碱基中后8个碱基缺失或突变。2) 编辑位点缺失6个碱基的株系占总突变株系的28.6%,编辑位点缺失8个碱基的株系占总突变株系的42.9%,GT碱基突变株系占总突变株系的28.6%。3) 水稻突变体的株高、鲜重、根系活力均小于野生型;根系扫描结果显示水稻突变体的根长、投影面积、表面积和侧根数均大于野生型;Cas-2的叶绿素和可溶性糖含量显著高于野生型,Cas-7的叶绿素和可溶性糖含量小于野生型,但差异不显著。【结论】CRISPR/Cas9基因编辑系统成功将水稻中McPht的同源体OsPht基因进行了编辑,所获得的水稻磷转运蛋白OsPht基因碱基缺失或突变不仅为所编辑基因的功能研究提供有效的科学依据,同时为冰叶日中花McPht磷转运蛋白基因导入OsPht基因功能缺失的水稻株系、验证其生理生化功能提供宝贵的评价材料支持。本研究表明基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统在功能性评价植物养分转运蛋白基因方面是一条有效的途径。     

水稻多胚基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

为构建水稻多胚基因OsPE的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以OsU6a启动子为模板,通过两轮Overlapping PCR构建出一个sgRNA的表达盒。在T_4连接酶的作用下,将sgRNA表达盒连接到酶切后的CRISPR/Cas9编辑载体中。先进行菌液PCR验证和酶切验证,后通过测序检测,获得一套多胚基因的pYLCRISPR/Cas9-gRNA载体,为多胚基因的进一步研究提供新的路径。     

基于CRISPR系统基因编辑与基因调控技术的发展

由规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)组成的系统被发现广泛存在于细菌及古菌中,是机体长期进化形成的由RNA指导的降解外源遗传物质的适应性免疫系统。由于该系统可以识别靶向序列完成DNA的双链切割,因此从2013年起,CRISPR/Cas9系统即被改造为基因编辑工具。作为一种新型的基因组编辑技术,CRISPR/Cas9系统具有设计简单、特异性强、效率高等优点,为基因组定向改造调控和应用带来了突破性的革命,并且迅速在基础理论、转基因动物生产、基因诊断和临床治疗等领域中得到广泛的研究与应用。然而,CRISPR/Cas9也存在着脱靶效应和外源基因插入困难等一些亟待解决的问题,这在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用。因此,近年来围绕CRISPR系统改进获得了一系列可用于基因编辑与基因表达修饰的新工具。本文介绍了CRISPR系统的组成、工作原理,并综述了近几年来基于CRISPR系统开发的几种新型基因编辑工具以及基因表达修饰工具的研究进展和应用,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

基于CRISPR/Cas9技术对水稻细胞质分裂关键基因OsMAP65-3s的编辑

MAP65-3是植物胞质分裂的重要调节因子。为探究水稻OsMAP65-3基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻中OsMAP65-3基因(OsMAP65-3.1和OsMAP65-3.2)进行编辑。针对每个基因各设计了2个不同的靶位点,并将OsMAP65-3.1与OsMAP65-3.2的靶位点放在同一个载体上,构建了CSMAP65-3A和CSMAP65-3B 2个双基因编辑载体。通过农杆菌介导的遗传转化分别获得17和21个植株,PCR鉴定阳性植株分别为16和20株。对T₀代植株靶位点附近序列进行测序分析,结果表明OsMAP65-3s基因均被成功编辑,OsMAP65-3.1 2个位点编辑效率为17.50%和9.38%,OsMAP65-3.2 编辑效率为15.62%和45.00%;T₀代已获得osmap65-3.2、osmap65-3.2/OsMAP65-3.1(+/-)和OsMAP65-3.2(+/-)/OsMAP65-3.1(+/-)材料。本研究为进一步创制OsMAP65-3s突变体,开展基因功能研究和水稻胞质分裂分子机制解析奠定了理论基础。     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

CRISPR/Cas9介导的番茄SlMAPK6突变对植株形态的影响

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号参与调控植物的多种逆境、生长发育以及花青苷的合成通路。为探究SlMAPK6在番茄中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计3个靶标位点定点编辑SlMAPK6,并获得突变体CRISPR-3和CRISPR-7。PCR和测序结果发现SlMAPK6敲除载体构建成功。通过对T₁植株进行卡那霉素基因筛选、靶位点扩增测序及行脱靶效应分析,结果发现矮番茄植株成功突变且未脱靶,与野生型对照表型相比,所有突变植株表现出根系更发达、侧枝增多的表型,表明SlMAPK6在番茄植株形态建成的过程中发挥了重要作用,为进一步探究SlMAPK6在番茄生长发育中的作用奠定了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在作物中的应用

CRISPR/Cas9是由小导向RNA介导的基因组定向编辑技术。自2005年以来,该技术得到飞速发展,在生物学、医学和作物遗传育种等多个学科得到广泛应用。与以往的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)及类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)相比,CRISPR/Cas9技术具有独特的优越性,以其简便的操作和极高的编辑效率成为目前最主要的基因编辑技术。本文系统阐述了CRISPR/Cas9技术的起源发展、基因编辑特点,总结了该技术在作物基因编辑和其他方面的应用,旨在为利用该技术进行农作物种质创新、基因挖掘和育种提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在水稻分子育种中的应用

CRISPR/Cas9是目前广泛应用的基因编辑技术,其操作方便、效率高、成本低.水稻作为全球粮食安全的战略作物,优质高产的水稻培育尤为重要,CRISPR/Cas9技术为水稻分子育种带来了突破.本文回顾了基因编辑技术的发展,详细介绍了CRISPR/Cas9系统的结构、组成及原理,重点阐述了该技术在水稻分子育种中的应用,探...     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

硝酸还原酶基因启动子NRE2元件缺失对烟草氮代谢的影响

为了探究硝酸还原酶基因启动子中硝酸盐响应元件NRE2缺失对烟草植株氮代谢的影响,以烤烟品种K326为材料,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了烟草NIA11和NIA2基因启动子中NRE2元件缺失的突变体材料,并于同一氮素营养条件下培养,测定烟草植株氮代谢相关生理指标.结果表明,与野生型相比,单突变体和双突变体叶...     

Efficiency and energy use in puddling of lowland rice grown on Vertisols in Central India

Transplanting of rice seedling in puddled soil is one of the most widely used cultivation practices. The present research is aimed at determining what specific implements are needed to obtain optimal puddle bed for transplantating. Puddling experiments were carried out by the use of pair of bullocks with traditional country plough (T₁), pair of bullocks with lug wheel puddler (T₂), power tiller with rotary puddler (T₃), tractor with cage wheel and 9-tine cultivator (T₄) and tractor with cage wheel and rotavator (T₅). One summer ploughing was done at friable moisture condition (18.6% db) and then tilled soil was flooded to saturation (24 h) for preparation of puddled bed. Weeding efficiency, puddling depth, percentage increase in bulk density, puddling index, percolation rate and grain yield of paddy were studied for the above treatments. Puddling performance by different implements in comparison to the traditional animal drawn country plough (T₁) shows that there is a definite reduction in time requirement for field preparation. Increase in weeding efficiency, bulk density, grain yield and puddling index were also observed. The highest values of weeding efficiency and puddling index were found 98.6% and 79.3, respectively, for rotavator (T₅). The total time requirement for preparation of puddle field for treatment T₄ (tractor with cultivator) was found to be the lowest (9.4 h ha⁻¹) with 67% weeding efficiency and 62.7 puddling index as compared to all other alternatives tested. Energy requirement for preparation of puddle field was found highest (2390 MJ ha⁻¹) for rotavator (T₅) followed by T₃, T₄, T₁, and T₂ treatments.     

隔盐方式对设施盐渍化土壤主要盐离子空间分布及酶活性的影响

针对设施土壤盐渍化日趋加重的现状,采用土柱模拟试验,以无隔盐层为对照,设置了3种隔盐层类型:砂砾层（T₁）,复合有机物料层（T₂）、砂砾+复合有机物料层（T₃）,探索不同隔盐模式的抑盐效果。结果表明:盐离子含量随着土层深度的增加而逐渐降低;就7种主要离子（Na⁺,NH₄⁺,K⁺,Ca²⁺,Cl^-,NO₃^-,SO₄^2-）总含量而言,T₃在0-10 cm,10-20 cm和20-30 cm时分别较CK降低了13.5%,0.61%和27.0%,效果较好;T₁和T₂隔盐效果不明显。0-30 cm土层,T₃分别增加了脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性达7.30%,4.70%,3.58%,降低了过氧化氢酶活性达8.53%;而T₁则趋势相反。说明T₃可以较好地抑制设施盐渍化土壤盐离子在耕层的聚集,同时可以提高土壤酶活性,对改善设施盐渍化土壤质量具有一定的作用。     

含枯草芽孢杆菌肥料对大豆叶片光合作用及土壤酶活性的影响

为了减少大豆生产过程中化肥的施用量及对黑土地的保护,开展大豆田间试验,分别施用大豆专用复合肥(CK)、枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥(T₁)、枯草芽孢杆菌+黄腐酸钾肥(T₂)、枯草芽孢杆菌+海藻精粉颗粒肥(T₃)、枯草芽孢杆菌秸秆腐熟有机肥(T₄)、枯草芽孢杆菌鸡粪腐熟有机肥(T_5),综合评价各种肥料对大豆光合作用和土壤酶活的作用效果。结果表明:光合参数方面,T₁、T₄和T_5处理的净光合速率较CK增加了5.0%、0.7%和8%,但差异不显著;蒸腾速率的最大值为T_5,较CK增加了30%,最小值为T₂,较CK降低了43.1%;气孔导度从高到低依次为T_5>T₄>T₁>CK>T₃>T₂,其中T₂、T₃和T_5与CK差异显著;T₂处理胞间CO_2浓度最低,较CK显著降低了12.0%,T₁、T_5处理较CK分别增加了5%和7%。叶绿素含量中,T₄和T_5的叶绿素含量均显著低于CK,T₁处理的叶绿素a含量最高,较CK增加了17.3%,T₂处理的叶绿素b含量较CK提高了2%,T₃处理与CK相比无明显变化。各处理的土壤脲酶活性均显著高于CK T_5处理为最大值,较CK提高17.7%;土壤蔗糖酶从高到低依次为T₁> T₃>CK>T₁>T₄>T₂,其中T₁较CK提高了18.9%,T₂较CK降低了27.8%;土壤碱性磷酸酶的最小值为T₃处理,酶活仅为8.55 mg·g^-1,最大值为T₄处理,较CK增加了7%。作为环境友好肥料,枯草芽孢杆菌+氨基酸型有机肥、枯草芽孢杆菌秸秆腐熟有机肥和鸡粪枯草芽孢腐熟有机肥部分代替化肥,具有应用潜力。     

抗盐碱剂对盐碱胁迫条件下双季稻渗透调节物质及根系活力的影响

  目的  为筛选合适的抗盐碱剂供盐碱地水稻生产应用。  方法  本研究以早稻品种陵两优942和晚稻品种Y两优911为材料,采用盆栽土培法研究了几种抗盐碱剂（T₁微纳米硅、T₂矿源黄腐酸钾、T₃盐碱、T₄松土精 + 矿源黄腐酸钾）对盐碱胁迫条件下（CK₁盐碱胁迫、CK₂无盐碱胁迫）水稻渗透调节物质、根系活力及产量的影响。  结果  水稻的SPAD值、渗透调节物质、根系活力和产量会受到盐碱胁迫的显著影响,中度胁迫造成的影响高于轻度胁迫造成影响;施用抗盐碱剂有利于缓解盐碱胁迫的不利影响,且在盐碱胁迫较重时效果更明显。在中度盐碱胁迫下,与CK₁相比,施用抗盐碱剂T₁、T₂、T₃、T₄,叶片SPAD、根系活力、产量显著增加,叶片游离脯氨酸含量、可溶性糖含量显著下降;与CK₂ 相比,CK₁减产40.8%,施用抗盐碱剂则使Y两优911在盐碱胁迫条件下减产幅度显著减小,T₁、T₄、T₃、T₂分别比CK₁产量高出53.9%、31.1%、21.1%、16.3%。  结论  不同处理间综合表现以T₁（微纳米硅）和T₄处理（松土精 + 矿源黄腐酸钾）表现最佳,是盐碱地水稻增产增收的有效措施。