陆地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

【目的】克隆了1个在棉纤维发育次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子基因Gh MYB52(Gh_A12G2460)。本研究旨在分析该MYB转录因子在陆地棉纤维次生壁发育过程中的作用。【方法】通过一步克隆法,从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆了1个在纤维次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB转录因子基因Gh_A12G2460,进化树分析结果表明Gh_A12G2460与拟南芥中AtMYB52基因的相似度最高,因此将其命名为Gh MYB52。通过进化树构建、氨基酸序列多重比对、定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、烟草瞬时转化、酵母双杂交等对其基因结构、编码产物的结构、表达特征、亚细胞定位以及互作蛋白进行了分析。【结果】GhMYB52基因的开放阅读框长672 bp,编码223个氨基酸残基,预测蛋白的相对分子质量为26.06 kDa,等电点为9.83。qRT-PCR结果表明,Gh MYB52基因在开花后15～25 d的棉纤维中优势表达。亚细胞定位结果显示,GhMYB52蛋白定位于细胞核,符合转录因子的特征。酵母转化结果显示,GhMYB52蛋白具有强烈的转录激活活性,并且与1个NAC类转录因子GhFSN1有强烈互作。【结论】GhMYB52是1个在棉花纤维次生壁加厚时期优势表达的R2R3类MYB转录因子,它可能通过与NAC类转录因子互作,形成蛋白复合物参与棉花纤维次生壁加厚过程。本研究为进一步从分子水平上验证GhMYB52基因在棉花纤维发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子,广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1（GenBank登录号：EF651783）。该cDNA序列长1115bp,其开放读码框长度为771bp,编码256个氨基酸。表达特征分析表明,该基因在陆地棉7235不同组织中均表达,但表达量不同,特别在开花前1d,开花后8d和11d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守,但在非编码区差异较大,在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝,推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC1作图群体,将GhTF1定位在染色体10上。     

一个新的棉花MYB类基因(GhTF1)的克隆及染色体定位分析

MYB类转录因子是指含有MYB结构域的一类转录因子, 广泛参与植物发育和代谢调节。含2个MYB结构域的R2R3类MYB转录因子在植物体内主要参与次生代谢的调节和控制细胞的形态发生。从优质材料7235不同发育时期的棉纤维混合cDNA文库中克隆了一个棉花MYB转录因子基因GhTF1(GenBank登录号: EF651783)。该cDNA序列长1 115 bp, 其开放读码框长度为771 bp, 编码256个氨基酸。表达特征分析表明, 该基因在陆地棉7235不同组织中均表达, 但表达量不同, 特别在开花前1 d, 开花后8 d和11 d的纤维细胞中优势表达。该基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中开放读码框区的序列较保守, 但在非编码区差异较大, 在内含子区存在大片段插失和碱基替换现象。Southern杂交结果表明该基因在陆地棉基因组中存在2个拷贝, 推测A、D亚组中各有1个拷贝。利用海7124和TM-1两亲本配置的BC₁作图群体, 将GhTF1定位在染色体10上。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

紫粒小麦高原115中R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4A的克隆及功能分析

花青素在小麦生长发育中参与多种生理生化过程,关于花青素合成机理已被深入研究。本研究利用同源克隆从紫粒小麦高原115中克隆到Ta MYB3-4A基因。Ta MYB3-4A基因组为序列为853 bp,其完整开放阅读框序列为729 bp,含有一个124 bp的内含子;编码蛋白为242个氨基酸,具有典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白。利用不同的MYB蛋白构建系统发育树,Ta MYB3-4A编码蛋白与调控花青素合成的MYB蛋白聚为一类。Ta MYB3-4A与b HLH基因共同瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。不同组织特异性表达分析,Ta MYB3-4A基因在高原115胚芽鞘和种皮中表达量高,茎中次之,叶片和颖壳中表达量弱,但在根中并未检测到。研究表明Ta MYB3-4A基因编码蛋白为R2R3-MYB转录因子,调控小麦高原115不同组织中花青素生物合成。     

青稞hblt14．2基因的克隆及功能分析

根据大麦blt14.2基因序列设计引物,用青稞基因组DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列,命名为hblt14.2,在GenBank登录号为EF514912.该基因含470 bp,包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5'非翻译区和152 bp的3'非翻译区,编码82个氨基酸残基,富含G1y、A1a、Leu和Va1,与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性.与大麦bit14.2基因具98.9%同源性,所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别.将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中,构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt,通过农杆菌介导转化烟草,并对转基冈烟草进行抗寒性检测.结果表明,青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系.     

海岛棉GbMYB5基因的克隆及表达分析

为了挖掘鉴定棉纤维发育相关基因,本研究根据海岛棉RIL群体定位的纤维强度QTL位点,结合转录组数据及海岛棉全基因组数据库注释信息,筛选出1个R2R3类MYB转录因子基因Gbar_A11G032760.1,根据该基因的注释信息,克隆并命名该基因为GbMYB5,qRT-PCR分析发现,在纤维发育15、20、25 DPA (Days post anthesis),该基因在高FS (Fiber strength)材料中的表达量显著高于低FS材料,且在高FS材料中明显上调表达;氨基酸序列分析表明,GbMYB5基因的编码区长747 bp,编码248个氨基酸残基,氨基酸序列包含1个高度保守的HTH-myb DNA-binding domain;序列同源比较及系统发育进化表明,该基因与不同物种的MYB5相关蛋白氨基酸序列都存在1个高度保守的HTH结构域;GbMYB5和雷蒙德氏棉的MYB5聚集在同一分支上,该基因与雷蒙德氏棉的同类基因亲缘关系较近。利用qRT-PCR分析不同组织表达情况,发现GbMYB5基因在花瓣和花萼中极显著表达量,雌蕊和雄蕊中显著表达一般,茎组织中表达不显著。研究初步分析了该基因的氨基酸序列及表达模式,为今后棉花MYB转录因子在纤维发育阶段的功能及分子机制的研究提供依据。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

棉花GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定

MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D₅基因组数据库以AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因GrMYB0, 从徐州142中克隆了陆地棉的GhMYB0, 其开放阅读框长度为843 bp, 编码280个氨基酸。经过保守结构域分析和亚细胞定位确定GhMYB0为R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州142开花当天开始高调表达, 开花后20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变体gl-1中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用, 本试验为研究R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。     

刚毛柽柳液泡膜H~+转运无机焦磷酸酶ThVP3的克隆与表达分析

通过对刚毛柽柳转录组的分析,获得并克隆了1个H~+-PPase基因cDNA全长,命名为ThVP3。序列分析结果表明:ThVP3全长3 500 bp,包含2 406 bp完整的开放读码框,618的5'非编码区和476 bp的3'非编码区。该cDNA编码1个801个氨基酸的多肽,等电点为5.67,推测分子质量为84.86 k D。通过与其他物种的氨基酸多序列比对及系统进化树分析,发现ThVP3氨基酸序列与AtVP2(拟南芥)一致性达88%,属于Ⅱ型VP成员。ThVP3基因有15个跨膜区,并具有高度保守的3个结构域(CS1,CS2,CS3)。相对荧光定量RT-PCR结果表明,ThVP3在高盐及干旱胁迫下均呈现为表达上调,但在各胁迫时间点和不同组织中的表达模式有所差异,0.4 mol/L Na Cl胁迫处理下,地下部分3 h达到最大值后有不同程度的降低,地上部分24 h达到最大值,与地下部分比,地上部分呈现较高的表达量;20%(w/v)PEG 6000胁迫处理下,地下部分在3 h和12 h达到峰值,地上部分表达量逐渐升高,24 h达到最大值后逐渐降低,96 h达到第2个峰值。ThVP3的表达受盐旱胁迫的诱导,推测其可能在柽柳的胁迫应答中起着重要的作用。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

棉花TCP家族转录因子基因GhTCP1的克隆与表达分析

通过比对拟南芥、金鱼草、水稻和玉米等植物中已知TCP家族转录因子的氨基酸序列,根据保守区设计兼并引物,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早13号的DNA为模板,获得棉花转录因子基因GhTCP1的中间保守区序列。根据该段序列设计特异性引物,采用5'和3'RACE技术获得了全长cDNA序列,编码397个氨基酸。基因组DNA序列分析表明,GhTCP1基因含有一个内含子。棉花GhTCP1蛋白与其它植物中的TCP家族转录因子有较高的相似性,证明该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示,该基因在棉花的侧芽中特异表达。     

毛偃麦草Na~+/H~+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析

根据小麦和长穗偃麦草的液泡膜Na+/H+逆转运蛋白基因(TaNHX1、TeNHX1)全长序列设计引物,通过RT.PCR直接扩增的方法从毛偃麦草(Elytrigia trichophora L.)中克隆到了Na+/H+逆转运蛋白基因,命名为EtNHX1 (Accession numeber:EU876834).EtNHX1最大开放阅读框为1 641 bp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为59.8 kD的蛋白,预测等电点8.0.EtNHX1含有39个碱性氨基酸,37个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及128个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约47%的α-螺旋、20%的延伸链、4.5%的β-转角和28%的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,EtNHXl含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成跨膜螺旋.序列分析显示,EtNHX1与小麦(Triticum aestivum L.)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium L.)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate L.)、水稻(Oryza sativa L.)、角果碱蓬(Suaeaa corniculata L.)、小盐芥(Thellungiella halophila L.)等植物的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为98%、98%、96%、85%、68%和67%.序比对结果以及进化树分析均表明EtNHX1应为定位于毛偃麦草液胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白.     

燕麦葡聚糖合酶基因AsCSLH的克隆及特征分析

β-葡聚糖是燕麦发挥保健作用的重要功能因子,分离其合成关键基因有助于解析燕麦β-葡聚糖积累的分子机制。以高β-葡聚糖燕麦地方品种夏莜麦为材料, 通过RACE和染色体步移的方法克隆了燕麦β-葡聚糖合酶基因AsCSLH及其基因组序列并分析其序列结构特征,采用半定量RT-PCR方法研究该基因组织表达特性。分离出的燕麦CSLH基因包含6个内含子, 内含子剪接方式均符合GT/AG剪接规则,编码区全长2 277 bp,在序列上与水稻CSLH基因的编码区序列相似性最高并且所预测的编码蛋白含有相关多糖合成酶保守结构域。AsCSLH基因在燕麦各组织中均有表达,在灌浆期籽粒中表达水平最高。推测AsCSLH基因在燕麦籽粒的β-葡聚糖合成中起重要作用。