新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。     

3种猪孕酮受体基因(pgr)多态性分析

采用混合基因组DNA池PCR扩增和测序技术,对小梅山猪、枫泾猪、大白猪pgr基因的外显子区域进行扫描,共发现1个单核甘酸多态性位点(SNP)。外显子1序列中1 319 bp处发生C→T的碱基突变,即C1319T,未引起氨基酸的变化,属于同义突变;针对突变位点,建立错配PCR–限制性长度多态性(RFLP)方法进行检测,发现3种猪的pgr基因可以分为AA、BB、AB 3个基因型,小梅山和枫泾猪有AA、AB 2种基因型,大白猪中有BB、AB 2种基因型。     

热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用

构建了绵羊朊蛋白的原核表达载体,获得了高纯度的融合表达蛋白。并在热力学因素的作用下,研究了重组绵羊朊蛋白的构象转化。以基因型为ARQ/ARQ蒙古绵羊的血液DNA为模板,利用DNA重组技术,将绵羊朊蛋白正常成熟蛋白基因OvPrP插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效表达,获得的表达产物以包涵体形式存在,并对其进行纯化和复性。超滤浓缩后浓度约为0.5 mg/mL的OvPrP97-234,进行热力学处理,利用远紫外线圆二色谱(CD)分析热力学处理前、后蛋白的二级结构的变化,同时,对热力学处理前、后的蛋白进行了蛋白酶K抗性的检测,并对其高级结构进行了预测。结果表明:获得的表达产物经SDS-PAGE分析可见分子量为16kD的蛋白条带,Western-blotting的鉴定证实了所获得的蛋白是特异性的朊蛋白。经Jascow32软件分析,测得天然构象的OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为28.8%、β折叠为0%、转角和无规卷曲为71.1%,无蛋白酶K的抗性。经过热力学处理之后,OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为19.3%,β折叠为36.9%,转角和无规卷曲为43.8%,有一定...     

猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达

参考GenBank登录的猪肺炎支原体(Mhp)P46基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成引物,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)对猪肺炎支原体P46基因的3个位点进行定点突变,将此突变基因插入到表达载体pET-32a( )中,经IPTG诱导后成功地在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主菌中表达分子量约为63 500的融合蛋白.Western blotting分析表明,该融合蛋白具有较好的免疫原性.为猪肺炎支原体抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因在大肠埃希氏菌中的表达、纯化

将猪瘟兔化弱毒株Erns基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经PCR和双酶切鉴定以及序列分析,表明已成功构建了重组质粒。将重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达,经SDS-PAGE和Western-Blot检测,结果表明,融合表达蛋白的分子量约为55kD,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的45%。表达蛋白与兔抗CSFV多抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。利用GST亲和层析柱对Erns融合蛋白进行了纯化。     

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与stx1／2B融合基因的构建和表达

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157：H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗．其中亚单位疫苗具有很大优势。方法：构建表达tir和stxb的融合基因。将tir基因中间295个氨基酸残基（Tir295）与stxB亚基基因72个氨基酸串联。构建pET28a—stx2b—Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS--PAGE电沫检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果：薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％左右。结论：由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成．可刺激机体产生针时转位紧密素受体（Tir）和志贺毒素（stx）的抗体,在EHEC0157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

传染性支气管炎病毒(IBV)小囊膜蛋白基因的原核表达

以传染性支气管炎病毒(IBV)M41毒株为材料,克隆该毒株的小囊膜蛋白(E)基因,并将其连接到表达载体pGEX-6P-1中,转化到大肠杆菌BL21中。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST,大小约为26ku)融合后大小约为38ku,表明目的蛋白相对分子质量约为12.4。这一结论为E蛋白的进一步研究提供了条件。     

ESR基因型与青年母猪外周血液激素浓度的关系

采用放免法测定了不同ESR基因型青年母猪 (各 3头 )外周血液激素浓度的变化。结果表明 :4种激素浓度随着生理状况不同出现明显波动 ;3种ESR基因型雌二醇变化曲线一致 ,在发情同一时期 ,雌二醇浓度差异不显著 ;AA型和AB型孕酮变化曲线一致 ,在发情后第 7天 ,AA和AB基因型远高于BB型 (P <0 .0 5 ) ;在发情初期BB基因型FSH浓度显著比AA型高 (P =0 .0 5 ) ,但是在发情后第 14天AA型与AB基因型FSH浓度比BB型高 (P =0 .0 7)。没有检测到 3种基因型青年母猪LH浓度存在显著差异。     

E Protein Prokaryotic Expression of Avian Infectious Bronchitis Virus

The small envelope protein （E） gene of avian infectious bronchitis virus （IBV） M41 strain was cloned, and then it was subcloned into prokaryotic expressing vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli. BL21 and induced by IPTG. SDS-PAGE result showed that when objective protein fused with GST （about 20 ku）, the relative molecular mass of fusion protein was 38 ku. It indicated that objective protein was about 12.4 ku. The result showed that E protein was expressed successfully, it was useful to the subsequent E protein research.     

鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。     

绿盲蝽AlEcR-A的单克隆抗体制备及在外源20E诱导下的应答

【目的】获得绿盲蝽(Apolygus lucorum)蜕皮激素受体(A1EcR-A)原核表达的重组蛋白,制备单克隆抗体,分析绿盲蝽AlEcR-A在外源蜕皮激素(20E)诱导下mRNA及蛋白表达量的变化趋势,为进一步研究EcR的功能奠定前期基础,同时也为构建20E信号传导的网络图谱提供理论依据。【方法】在前期获得绿盲蝽AlEcR-A的基础上,将含有其基因的T载体经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切,构建AlEcR-A原核表达载体(pCzn1-AlEcR-A),将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白Ni-IDA亲和纯化,以获得AlEcR-A基因功能区的纯化蛋白。进一步用其进行免疫反应,取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA及Western blot筛选验证是否为目的抗体,通过抗体纯化,Western blot检测该抗体能否特异性结合AlEcR-A重组蛋白及绿盲蝽总蛋白,从而制备得到AlEcR-A蛋白单克隆抗体。最后利用RT-PCR及Western blot方法,进行20E微注射绿盲蝽2龄若虫,分析8 d内AlEcR-A的mRNA及蛋白含量的变化,明晰20E诱导下AlEcR-A的应答反应。【结果】经NdeⅠ和XbaⅠ双酶切后原核表达载体pCzn1-AlEcR-A在大肠杆菌Arctic express中能高效表达一个约为55 kD的蛋白,且该重组蛋白经IPTG诱导后主要以包涵体的形式存在;经Ni-IDA亲和层析后,pCzn1-AlEcR-A重组蛋白的包涵体纯度仅在55 kD附近有一条明显的特异性条带,说明靶蛋白已得到纯化。进一步通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备,获得了1株能稳定分泌抗AlEcR-A蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为8H7;Western blot分析表明,该细胞株不仅能与绿盲蝽总蛋白结合,还可特异性与AlEcR-A重组蛋白反应,且条带大小一致,说明制备的AlEcR-A单克隆抗体准确、有效;RT-PCR及Western blot结果表明,与注射蒸馏水相比,20E微注射处理后的绿盲蝽AlEcR-A mRNA表达量及蛋白表达量均显著升高,且随着处理时间的延长,其增值幅度也逐渐增高。【结论】获得了一株高特异性的能稳定分泌AlEcR-A单克隆抗体的细胞株,20E有诱导AlEcR-A mRNA及蛋白表达的作用。     

Jo-1蛋白在大肠杆菌中的克隆与表达

构建在E.coli中表达人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)的质粒。用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,将此片段定向克隆到麦芽糖融合蛋白表达载体pMAL-c中,诱导表达获得Jo-1的可溶性融合蛋白,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验表明,表达的融合蛋白能与含有抗Jo-1抗体的病人血清发生特异反应,重组融合蛋白具有Jo-1蛋白的免疫原性和免疫特异性。     

牧羊犬IFN-β基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序。结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽。成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区。二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成。犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85%～98.4%),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9%～8.6%。     

Identification of a novel thyroid hormone receptor expressed in the mammalian central nervous system

A complementary DNA clone derived from rat brain messenger RNA has been isolated on the basis of homology to the human thyroid hormone receptor gene. Expression of this complementary DNA produces a high-affinity binding protein for thyroid hormones. Sequence analysis and the mapping of this gene to a distinct human genetic locus indicate the existence of multiple human thyroid hormone receptors. Messenger RNA from this gene is expressed in a tissue-specific fashion with highest levels in the central nervous system.