RT-LAMP 及RT-PCR 方法快速检测玉米褪绿斑驳病毒的比较与应用

利用玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因为靶标序列设计引物,通过优化反应温度、引物浓度、反应时间以及评价环引物效果,建立了检测玉米褪绿斑驳病毒反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并与RT-PCR方法比较。结果表明,RT-LAMP在64℃等温条件下反应45min,最低可检测到280fg的目的片段,灵敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花叶病毒、玉米矮花叶病毒、小麦线条花叶病毒、玉米白线花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒等5种病毒为检测对象,证明该方法针对玉米褪绿斑驳病毒具有很强的特异性。利用RT-LAMP方法对100份模拟病毒感染的玉米种子进行检测,病毒检出率为100%。     

水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法（RT-LAMP）检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-PCR灵敏性基本一致。检测结果易于判定。【结论】RT-LAMP检测方法适合寄主植物和介体体内RBSDV的快速检测。     

植物病毒快速检测试剂盒问世

近日,中国农业科学院植物保护研究所作物病原生物功能基因组创新团队与浙江大学生物技术研究所等单位联合研制了针对1种农作物一类病毒(南方水稻黑条矮缩病毒)和3种检疫性植物病毒(玉米褪绿斑驳病毒、番茄褐色皱纹果病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒)的dot-ELISA (斑点酶联免疫吸附测定)快速检测试剂盒.     

鸭源新城疫病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立鸭源新城疫病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法,为鸭源新城疫病毒的快速诊断提供支持。【方法】选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列,利用Primer Explorer V4在线软件设计了3对RT-LAMP引物,以鸭源新城疫病毒SDFCH株RNA为模板进行RT-LAMP反应,通过对反应温度、时间及反应体系各组分浓度的筛选,优化反应体系和反应条件,然后对该方法的灵敏性和特异性进行检测(以RT-PCR方法为对照),并将其应用于临床病料检测。【结果】优化的RT-LAMP反应体系能够在63℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,反应结果可直接用肉眼判断;建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法特异性较强,灵敏度较高,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、禽偏肺病毒(aMPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)等的核酸无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标RNA(0.1pg/μL),较普通RT-PCR的灵敏性高10倍;利用建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法对24份疑似鸭源新城疫样品的阳性检出率为41.7%。【结论】建立的鸭源新城疫病毒的RT-LAMP检测方法,具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点。     

番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

A型塞内卡病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种利用逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,从SVA细胞培养液中提取总RNA,根据SVA VP1基因序列,设计一套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP检测方法。利用建立的RT-LAMP检测方法对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒与塞内卡病毒进行特异性试验。将SVA VP1质粒10倍梯度稀释液作为模板(1×10~0～1×10~7拷贝)进行RT-LAMP和RT-PCR反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。采集疑似发病猪的鼻腔拭子和水疱液共126份样品,应用RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化鉴定。结果表明,与传统RT-PCR相比,RT-LAMP检测方法灵敏度高1 000倍,且与其他病毒无交叉反应,具有高度敏感性和特异性。临床样品检测结果显示,鼻腔拭子样本SVA阳性率为29.6%,水疱液样本SVA阳性率为100.0%,2种方法检测结果一致,符合率为100%。综上所述,本研究建立的RT-LAMP检测方法准确、简便、经济有效,尤其适用于现场和基层实验室对SVA的快速诊断。     

山东水稻黑条矮缩病毒dsRNA提取与RT-PCR检测研究

水稻黑条矮缩病是由灰飞虱和白背飞虱等传播的病毒性病害,给水稻生产带来严重危害。通过提取水稻黑条矮缩病毒dsRNA发现,感病植株的dsRNA凝胶电泳存在8条带,而健康植株是空白结果,与报道的玉米粗缩病毒结果相同。根据水稻黑条矮缩病毒基因组序列的信息,在其S1和S10片段分别设计合成两对引物,对感染病毒植株和健康植株进行扩增,可在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病毒基因组特有的条带,而在健康植株中未能扩增出条带。利用此种方法可以建立水稻黑条矮缩病检测体系,对水稻黑条矮缩病进行早期检测和预报。     

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，提高检测灵敏度，实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物，采取单因素优化试验，对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg²⁺、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化，恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析，SYBR Green I可视化显色，结果表明：SPFMV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3 0.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO₄ 1.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为：FIP/BIP 2μL、F3/B3...     

杏褪绿卷叶植原体新疆分离物可视化LAMP检测方法的建立

为新疆杏褪绿卷叶病的田间快速诊断和检测提供新方法,根据杏褪绿卷叶植原体新疆分离物tuf基因保守序列,设计并筛选出1套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测杏褪绿卷叶植原体的LAMP检测方法。结果表明:建立的LAMP检测方法能特异性地检测出杏褪绿卷叶植原体,检测灵敏度是普通PCR的100倍,且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。     

纳米酶免疫层析试纸条法检测玉米褪绿斑驳病毒

【目的】建立纳米酶免疫层析试纸条(Nanozyme Immuno-chromatographic Strip Assay, NISA)检测玉米褪绿斑驳病毒方法。【方法】采用双抗夹心法,将纳米酶标记的鼠抗体IgG与McmV结合后,再与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)滴加显色。【结果】采用研制的NISA和反转录PCR法(RT-PCR)对玉米褪绿斑驳病毒梯度稀释的研磨液进行检测,灵敏度分别为10^-7和10^-5;用其他4种病毒作对照进行特异性实验,无交叉反应;用该试纸条对供试样品进行检测,并以RT-PCR方法及基因测序方法对检测结果进行验证,三者检测结果一致。【结论】该试纸条检测McmV的灵敏度高、特异性强,可用于科研、农业生产单位和口岸机构对McmV的检测。     

猪呼吸与繁殖综合症病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。     

牛病毒性腹泻病毒一步RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,为诊断与监测BVDV提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

我国主要玉米病毒病的鉴定及分类研究进展

玉米是重要的粮食作物，和人们的生活息息相关，但病害种类复杂，其中病毒病害存在极大威胁，可能会导致玉米产量损失惨重，当前病毒病的有效防治手段主要是利用高抗性品种，但该技术耗时费力，且依赖性高；在田间及时发现病毒病，尽早处理田间病株，是控制病毒病发生的有效手段，因此准确地识别玉米病毒病害，尽早进行检测鉴定并做出相关防治措施，可以最大程度降低损失。本文归纳了我国玉米上的主要病毒病害，主要包括引发国内玉米粗缩病、玉米矮花叶病、玉米红叶病、玉米鼠耳病以及玉米褪绿斑驳病的病原，归纳国内侵染玉米并造成危害的主要病毒，如水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等病毒，简述这些病毒的传播介体及主要传播途径，从源头上为预防玉米病毒病提供参考；同时整理相关病毒的基本信息，如病毒分类、病毒粒子特性、病毒基因组结构、病毒侵染植物后引发的症状等；旨在加深人们对生产上常见的玉米病毒病的认识和理解，以期为准确快速识别玉米病毒病提供参考，为田间防控提供理论支持。     

猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立与初步应用

[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。