microRNA-133诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究

为了探明microRNA-133(miR-133)在诱导脐带间充质干细胞分化为成肌细胞过程中的作用,试验采用脂质体法以化学合成的miR-133转染绵羊脐带间充质干细胞并进行续培养。当细胞呈现成肌细胞的形态特征时,采用qRT-PCR法、免疫荧光法和流式细胞术分别检测转染细胞中成肌细胞特异性基因Desmin与Myf5 mRNA的相对表达量、成肌细胞标记蛋白Desmin与MyoD的表达情况及表达成肌细胞标记蛋白的细胞比率。结果表明:转染并续培养后第28天,续培养的细胞有序生长并呈现融合趋势;qRT-PCR检测可见,转染细胞中成肌细胞特异性基因Desmin及Myf5 mRNA的相对表达量明显提高;与未转染细胞相比,转染细胞特异性表达成肌细胞标记蛋白MyoD和Desmin;此外,转染细胞中表达MyoD和Desmin的细胞比率分别为99.3%和99.0%。说明miR-133在绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞过程中发挥重要作用。     

腺病毒介导shRNA干扰绵羊MSTN基因效果及对生肌调节因子和干扰素反应基因表达的影响

旨在进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的调控机制,制备可有效失活MSTN基因的工具,为通过RNA干扰技术提高绵羊产肉量提供方法和理论依据。本研究以绵羊成肌细胞为试验材料,构建特异靶向绵羊MSTN基因的shRNA干扰质粒载体,将干扰效果好的质粒进一步包装为重组腺病毒,转染细胞后采用qRT-PCR和Western blot检测MSTN基因以及生肌调节因子和干扰素反应基因的表达。结果表明,质粒ShR218和ShR511干扰MSTN基因效率分别达到35%和48%,双元干扰质粒ShR3+4干扰效率最高达到85%。成功包装shRNA重组腺病毒载体Sh511和Sh3+4,病毒滴度达到1×10~8 pfu·mL~(-1),对成肌细胞的感染效率达到90%以上。Sh511和Sh3+4对MSTN基因mRNA的表达抑制分别达到53%和76%,对蛋白表达抑制分别达到55%和64%。MSTN基因沉默后,伴随着Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因mRNA水平的极显著性下调(P0.01),但只引起MyoG蛋白水平极显著升高(P0.01),未引起Myf5、MyoD、Myf6蛋白水平的显著变化;腺病毒感染成肌细胞未引起OAS1基因mRNA水平的显著变化,但引起IFNGR1基因mRNA水平的极显著升高(P0.01),对二者蛋白水平均无显著影响。本研究成功构建靶向MSTN基因的shRNA腺病毒载体,能有效抑制成肌细胞MSTN的mRNA和蛋白表达,并影响生肌调节因子Myf5、MyoD、MyoG、Myf6基因和干扰素受体基因IFNGR1表达。     

小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测

为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。     

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。     

DMSO在诱导绵羊脐带间充质干细胞为成肌细胞中的作用

为了探明二甲基亚砜(DMSO)在绵羊脐带间充质干细胞(MSCs)分化为成肌细胞的作用,研究将绵羊MSCs用含有DMSO的F12/DMEM合成培养基进行诱导培养后观察其细胞形态、免疫荧光并利用流式细胞仪检测成肌细胞特异因子,如肌分化因子(Myo D)、肌间线蛋白(Desmin)、肌细胞生成素(Myo G)等的表达及RT-PCR检测成肌细胞特异因子的相对表达量。结果表明:与对照组(不含DMSO的F12/DMEM培养基)细胞形态不发生变化相比,用含DMSO的F12/DMEM培养基诱导培养21 d后,其细胞由长梭形变为具有成肌细胞特点的细长管状;在开始诱导培养后的第16天进行成肌细胞标志性蛋白Myo D、Desmin、Myo G抗体免疫荧光检测,与对照组呈现阴性相比,所诱导细胞呈阳性。用流式细胞仪的检测结果显示,诱导细胞的表达成肌细胞特异因子Myo D、Desmin、Myo G的阳性细胞率分别为99.3%、99.5%、86.6%;RT-PCR的检测结果显示,与对照组(表达量为1)相比,诱导细胞的Myo D、Myo G、Desmin相对表达量均升高,分别为(3.71±0.01)倍、(1.86±0.01)倍、(5.27±0.01)倍。表明DMSO具有诱导绵羊MSCs分化为成肌细胞的功效。     

绵羊Oct4基因启动子的表达活性分析

Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。     

GC_SBE元件突变对绵羊Myomaker基因5'调控区活性的影响

为了研究Smad蛋白结合元件GC_SBE对绵羊Myomaker基因5'调控区转录调控活性的影响,试验将GC_SBE元件突变为特定酶切位点EcoRⅠ,构建元件突变型真核表达载体MyomakerProGC_SBEM-EGFP,并转染至C2C12成肌细胞中,用荧光定量PCR法检测突变组GC_SBE元件突变对不同状态下EGFP mRNA表达的影响,同时以转染野生型绵羊MyomakerProW-EGFP真核表达载体的细胞作为对照。结果表明:成功构建了绵羊Myomaker ProGC_SBEM-EGFP载体;与对照组比较,在成肌细胞未分化状态下GC_SBE元件突变后导致EGFP mRNA表达下调,在成肌细胞分化状态下GC_SBE元件突变后则导致EGFP mRNA表达上调。说明GC_SBE元件突变对绵羊Myomaker基因5'调控区的转录调控活性存在影响,且这种影响与细胞的状态有关。     

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

缝隙连接蛋白43对小鼠子宫基质细胞蜕膜化的影响

缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是缝隙连接蛋白家族成员之一,广泛存在于哺乳动物器官和组织中,参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程。本试验参照Gen Bank中已发表的Cx43基因序列,设计特异性引物,进行PCR扩增。为了提高构建过表达重组质粒的效率,PCR产物先与p GEM-T载体进行连接,经双酶切后与pc DNA3.1载体融合得到过表达重组质粒,经双酶切和测序鉴定后将其转染到体外分离培养的小鼠子宫基质细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)方法检测Cx43 mRNA表达变化及Cx43过表达对蜕膜化标志性分子表达的影响。结果表明,与空载体转染组相比,重组质粒pc DNA3.1-Cx43转染子宫基质细胞后可使小鼠子宫基质细胞Cx43 mRNA的表达量显著升高,同时Cx43过表达可使子宫基质细胞蜕膜化标志性分子Prl8a2和Prl3c1 mRNA的表达量均显著升高,表明Cx43可促进小鼠子宫基质细胞发生蜕膜化。     

中国林蛙抗菌肽Temporin-1 CEa基因的真核表达载体构建

为了建立大量获取中国林蛙抗菌肽的方法,根据GenBank中的中国林蛙皮肤抗菌肽Temporin-1CEa基因的mRNA序列(EU624139)设计一对特异性引物,以提取的中国林蛙皮肤总RNA反转录出的cDNA为模板,将扩增的编码序列与pEASY-T3克隆载体连接获得Tem-T3;利用酶切、连接等分子生物学手段,将GFP基因连入Tem-T3克隆载体,再经酶切获得Tem-GFP片段,并插入真核表达载体pcDNA3.1,最终得到Tem-GFP-pcD-NA3.1重组质粒;利用脂质体转染法将该质粒转入绵羊成纤维细胞,48 h后可在荧光倒置显微镜下观察到GFP的绿色荧光表达;qPCR数据分析显示,与对照组相比,转染Tem-GFP-pcDNA3.1的绵羊成纤维细胞中融合蛋白Tem-GFP的表达量可提高约300倍。本研究为构建Temporin-1CEa基因山羊乳腺特异表达载体提供依据。     

Study on Differentiation of Sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells into Muscle Cells Induced by Mouse MyoD Gene

In order to investigate the differentiation of sheep umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs) into muscle cells induced by mouse MyoD gene. This study based on the previous work constructed the eukaryotic expression vector of MyoD-pcDNA3.1 in mice, and the vector was transfected into sheep UCMSCs. The morphological changes of cells were observed by fluorescent microsco, the expression of MyoD, Desmin and MyoG genes were detected by immunofluorescence, the percentage of cells expressing the cell specific factor (MyoD, Desmin and MyoG) was analyzed by flow cytometry and Real-time quantitative PCR to detect the relative expression of mRNA relative to muscle cell specific factor. Compared with the control group (no transfection), the vector was transfected into sheep UCMSCs, it was found that the cells were transformed into a long, slender, muscular cell state, and the cell spiral gradually disappeared at 21th day. It was found that MyoD and Desmin showed positive expression by immunofluorescence assay at 8th day, the expression of MyoG was also found after 16 d of induction, and the expression of MyoD decreased, the amount of Desmin expression was no change;By flow cytometry, the percentages of the expression of MyoD, MyoG and Desmin were 93.5%, 97.4% and 99.5%,respectively;Real-time quantitative PCR results showed that the relative expression of MyoD, MyoG and Desmin were increased and compared with the control group (non transfected cells), the cells were increased by 2.046, 2.389 and 5.489 times, respectively. The results showed that mouce MyoD gene could induce the differentiation of sheep UCMSCs into muscle cells.     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素(MSTN)对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖(DCN)为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2(si-DCN)转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期(GM)牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天(DM3)的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),且EdU阳性细胞率显著增加(P<0.05),表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组(P<0.01;P<0.05),MyHC在mRNA水平显著降低(P<0.05),但在蛋白水平上极显著升高(P<0.01),免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组(P<0.05),说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

miR-143在肌细胞中的表达及其影响

本试验旨在研究microRNA-143(miR-143)对小鼠肌细胞增殖和分化的影响。利用Real-time PCR方法对细胞不同分化时期进行检测,并且在小鼠肌细胞C2C12中通过转染miR-143 mimics和Inhibitor对标志基因myogenin(MyoG)进行检测,然后利用免疫荧光和Western blotting方法对组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因表达水平进行检测。结果表明,miR-143与肌细胞的增殖和分化密切相关,过表达miR-143后,肌细胞标志基因MyoG出现下调,敲低后结果相反,且在分化细胞中过表达miR-143,免疫荧光和Western blotting结果显示,标志基因MHC的表达水平下降。因此,miR-143是一个潜在的影响肌肉生长发育的microRNA,为以后肌肉发育和功能的研究提供了一个新的资料。     

绵羊骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定与成肌诱导分化

试验旨在分离绵羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells，SMSCs），建立绵羊SMSCs体外分离、培养及鉴定体系，为后续研究提供种子细胞。以新生健康绵羊为试验动物，采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步酶消化法和差速贴壁法分离并纯化SMSCs。用RT-PCR和免疫荧光法鉴定SMSCs标记基因配对盒基因7（paired box 7，Pax7）、结蛋白（Desmin）和生肌调节因子1（myogenic regulatory factors 1，MyoD1）的表达情况；用血清撤离法诱导SMSCs向成肌细胞方向分化，成肌诱导后观察肌管的形成，免疫荧光法检测成肌分化特异性标志肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）的表达。RT-PCR结果显示，扩增条带与预期相符，所分离细胞表达SMSCs标记基因Pax7、Desmin和MyoD1；免疫荧光鉴定结果显示，所分离细胞表达SMSCs标记蛋白Pax7、Desmin和MyoD1；成肌诱导后镜下可见细胞相互融合形成多核的肌管，并表达成肌特异性标志MHC。本试验分离了绵羊SMSCs，建立了适用于绵羊SMSCs的体外培养体系，并成功进行了成肌诱导分化，为今后研究绵羊骨骼肌生长发育机制提供了试验材料和技术支撑。     

干扰核心蛋白聚糖对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为探究肌肉生长抑制素（MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究以前期MSTN^+/-蒙古牛与野生蒙古牛腿臀肌肌肉组织定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学筛选获得的表达差异倍数较大的核心蛋白聚糖（DCN）为靶标,以实验室前期分离培养的牛骨骼肌卫星细胞及建立的体外诱导成肌分化模型为对象,通过对设计合成的3个DCN siRNA干扰效果的筛选,将干扰效果最显著的si-DCN-2（si-DCN）转染牛骨骼肌卫星细胞。采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测增殖期（GM）牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志因子Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,以及使用EdU染色的方法检测干扰DCN对细胞增殖的影响。对转染DCN siRNA的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化第3天（DM3）的肌管形成状态,同时采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分化标志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白水平的表达变化,并对DM3期肌管MyHC进行免疫荧光染色,以研究干扰DCN对细胞分化的影响。结果显示,干扰DCN表达后,增殖期牛骨骼肌卫星细胞中Pax7和MyoD的mRNA水平及蛋白水平都显著或极显著上调（P<0.05;P<0.01）,且EdU阳性细胞率显著增加（P<0.05）,表明干扰DCN表达显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖。干扰DCN表达后,牛骨骼肌卫星细胞分化第3天诱导形成的肌管直径呈现增大趋势,检测成肌分化标志因子MyoG在mRNA和蛋白水平的表达分别极显著和显著高于对照组（P<0.01;P<0.05）,MyHC在mRNA水平显著降低（P<0.05）,但在蛋白水平上极显著升高（P<0.01）,免疫荧光结果显示,下调DCN后肌管融合指数显著高于对照组（P<0.05）,说明干扰DCN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰DCN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。研究结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究奠定了基础。     

circRNA-Zfp609对C2C12成肌细胞增殖和分化的影响

【目的】试验旨在探究circRNA-Zfp609调节C2C12成肌细胞增殖和分化的潜在分子机制。【方法】利用RT-PCR和测序分析小鼠骨骼肌组织和C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的表达,实时荧光定量PCR检测小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、骨骼肌组织及增殖12、24、36、48 h和分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中circRNA-Zfp609的相对表达量;实时荧光定量PCR检测分化0、1、3、5 d的C2C12成肌细胞中肌细胞生成素（MyoG）和肌球蛋白重链（MyHC）的相对表达量。用circRNA-Zfp609的干扰表达载体（siRNA）干扰细胞,通过CCK-8测定siRNA对C2C12成肌细胞增殖率的影响;用实时荧光定量PCR检测siRNA干扰对circRNA-Zfp609、MyoG和MyHC相对表达量的影响。通过TargetScan 7.0和miRDB软件预测circRNA-Zfp609上与肌肉分化相关的miRNA位点,将筛选的miRNAs的过表达载体转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609与miRNA的互作关系。根据miRNAs对circRNA-Zfp609的互作,构建circRNA-Zfp609的野生型和突变型载体并转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验验证circRNA-Zfp609对miRNA的靶向关系。【结果】PCR和测序结果表明,小鼠骨骼肌中可表达circRNA-Zfp609;circRNA-Zfp609在小鼠骨骼肌中表达水平最高,在其他组织中的表达量由高到低依次是肾脏、肺脏、心脏、肝脏、胃、脾脏和小肠。与12 h相比,在C2C12成肌细胞增殖的36和48 h circRNA-Zfp609的相对表达量显著增加（P<0.05）;与分化第0天相比,在C2C12成肌细胞分化的第1、3和5天circRNA-Zfp609的相对表达量均显著增加（P<0.05）,MyoG、MyHC的相对表达量均极显著增加（P<0.01）。与NC组相比,siRNA组C2C12成肌细胞的增殖率和circRNA-Zfp609相对表达量均极显著降低（P<0.01）,MyoG和MyHC的相对表达量显著降低（P<0.05）。circRNA-Zfp609上有miR-150-5p、miR-327、miR-344g-3p和miR-615-5p 4种与肌肉分化相关的miRNAs。circRNA-Zfp609与miR-615-5p的吸附能力最强,具有靶向结合作用。circRNA-Zfp609可以作为分子海绵与调控肌肉分化相关的miR-615-5p相互作用。【结论】circRNA-Zfp609在小鼠的组织中广泛表达,在骨骼肌中表达水平最高;circRNA-Zfp609在C2C12成肌细胞增殖和分化的不同时期差异表达,circRNA-Zfp609上有4个与肌肉分化相关的miRNAs,其中miR-615-5p与circRNA-Zfp609具有靶向关系。本研究结果可为与家畜骨骼肌生长发育相关的研究提供参考。     

多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及成肌诱导分化

为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞（satellite cells,SCs）,并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs。利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化。通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）的免疫荧光,检测肌管的形成情况。通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs。采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成。本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化。     

Isolation,Culture,Identification and Myogenic Differentiation of Skeletal Muscle Satellite Cells in Duolang Sheep

To mimic muscle development of Duolang sheep in vitro,we employed a two-step digestion method to separate satellite cells（SCs）and a differential adhesion method to purify the cells in Duolang sheep.Moreover,observation of microscopic images and immunofluorescence were used for identifying Duolang sheep SCs and its myogenic differentiation.Using immunofluorescence for Desmin,Pax7 and MyoD1 genes,we demonstrated that these marker genes all expressed in the SCs.The SCs formed significant myotubes when the serum was withdrawal from growth media,confirmed by the immunofluorescence for MHC and microscopic images.Taken together,we ssuccessfully isolated SCs and established the myogenic differentiation of SCs.     

STAT3基因对广西黄牛肌肉干细胞成肌诱导分化的调控研究

研究旨在检测信号转导与转录激活因子3（STAT3）的表达规律，克隆STAT3基因，构建真核表达载体，并探索STAT3基因对广西黄牛肌肉干细胞（MuSCs）分化的调控作用。采集6、12、18月龄广西黄牛肌肉组织以及生长期（GM）和分化期（DM）肌肉干细胞，分别提取RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测STAT3基因和成肌相关基因的表达规律；克隆黄牛STAT3基因完整编码区序列，构建过表达载体pCD-STAT3并检测其对黄牛肌肉干细胞分化的影响。实时荧光定量PCR结果表明，STAT3基因在6、12、18月龄黄牛肌肉组织中均有表达，且在18月龄中表达量最高，12月龄中表达量最低；STAT3和成肌调节因子6（MYF6）基因在分化期肌肉干细胞中表达量均极显著高于生长期（P<0.01）。广西黄牛STAT3基因编码区全长2 313 bp，与空载体pCDNA3.1相连成功构建过表达载体pCD-STAT3，将pCD-STAT3转入体外培养广西黄牛肌肉干细胞，肌肉干细胞中STAT3基因及成肌决定蛋白（MyoD1）、骨骼肌肌球蛋白重链（MyHC）基因表达量极显著升高（P<0.01），肌细胞生成素（MyoG）基因表达量显著升高（P<0.05），且肌管数量、大小均显著高于pCDNA3.1组（P<0.05）。本研究检测了转录因子STAT3在广西黄牛背最长肌中的表达规律；且过表达STAT3基因显著促进了广西黄牛肌肉干细胞的成肌分化，为深入研究STAT3基因在肌肉生长发育中的作用及其分子调控机制奠定基础。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。