慢病毒载体在制备转基因动物中的最新进展

慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒，由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶，故现名为逆转录病毒。慢病毒载体（Lentivirus vectors）与简单的逆转录病毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前制备转基因动物的载体之一。     

慢病毒载体构建策略及生物安全性研究进展

慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞,是较有前途的病毒载体,来源于HIV-1型载体,能阻止形成有复制能力的HIV-1病毒,构建一个更为安全的模式是慢病毒载体构建策略的焦点。该文介绍了慢病毒载体应用过程中的不同载体系统及构建策略,对载体的生物安全性进行了分析,展望了慢病毒在基因治疗、RNA干扰及转基因领域的应用前景。     

猪精子与慢病毒作用机制的探讨

在制备转基因动物的方法中,精子载体法(与质粒结合)因操作简单而备受关注,但整合效率低,遗传稳定性较差,而慢病毒载体具有良好的感染效率和整合效果,慢病毒与精子孵育制备转基因动物是转基因方法的有益尝试。本研究采用这一新方法成功制备出转基因猪。为了探索精子与慢病毒的相互作用机制,首先制备慢病毒,经梯度稀释法测定其滴度为1.2×105 ifu/mL。然后,用DNA酶消化去除慢病毒液中载体质粒,将慢病毒液与精子在17℃下共孵育2h后,再用RNA酶消化慢病毒颗粒,对精子进行RT-PCR、PCR和FISH检测。结果提示,慢病毒颗粒可能进入精子中。该发现为这一转基因新方法的建立提供了理论依据。     

利用逆转录病毒侵染技术制备转基因动物研究进展

转基因技术已成为现代生命科学中的一项重要技术,它不仅广泛地用于研究基因的功能,同时也用来快速改变生物的遗传性状。本文简要介绍了利用逆转录病毒侵染技术制备转基因动物的原理,概述了此项技术近年的研究进展。在比较了原核显微注射与慢病毒侵染技术优缺点的基础上,进一步提出慢病毒侵染技术可能成为一种制备转基因动物的较好工具。     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒载体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

马传染性贫血病毒的研究进展

慢病毒跟其他逆转录病毒一样,可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上,并且在感染的细胞和子代细胞中表达病毒基因,可以作为将目的外源基因引入细胞的载体.慢病毒不但能够感染分裂状态的细胞,而且还具有感染非分裂细胞的能力,因而,慢病毒载体备受关注.以HIV-1为基础的慢病毒基因转移载体是目前研究最为透彻的慢病毒载体.尽管已经在增加HIV载体的生物安全性和减少产生具备复制能力的病毒方面作了很多改进,但若应用于人类临床试验,仍然存在较大的安全隐患.因此,开发非灵长类慢病毒基因转移载体系统已成为当前研究的热点之一.     

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具,能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞.将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达,它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段.应用慢病毒栽体进行转基因动物的制备,转基因的效率将得到显著提高.慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点,它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰.该技术被广泛用于基因功能的研究,在疾病的基因治疗上也具有良好的前景.     

慢病毒载体的研究进展及应用

慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用。作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述。     

逆转录病毒载体介导的转基因鸡研究进展

转基因鸡作为重要的经济动物和理想的生物反应器,具有广阔的应用前景。鸡基因组测序的完成加快了转基因鸡的研究和发展。病毒载体法是转基因鸡制备的主导方法之一,具有效率高和遗传稳定性良好的优势。本文对逆转录病毒载体特征、复制缺陷型病毒载体和复制整合双缺陷型病毒载体的优缺点及其介导的转基因鸡研究进行综述,展望人工核酸酶技术结合复制整合双缺陷型逆转录病毒载体在转基因鸡研究领域的应用前景。     

An efficient strategy for generation of transgenic mice by lentiviral transduction of male germline stem cells in vivo

Background: Male germline stem cells(MGSCs) are a subpopulation of germ cells in the testis tissue. MGSCs are capable of differentiation into spermatozoa and thus are perfect targets for genomic manipulation to generate transgenic animals.Method: The present study was to optimize a protocol of production of transgenic mice through transduction of MGSCs in vivo using lentiviral-based vectors. The recombinant lentiviral vectors with either EF-1 or CMV promoter to drive the expression of enhanced green fluorescent protein(e GFP) transgene were injected into seminiferous tubules or inter-tubular space of 7-day-old and 28-day-old mouse testes. At 5 or 6 wk post-surgery, these pre-founders were mated with wild-type C57BL/6J female mice(1.5 to 2.0-month-old).Results: Sixty-seven percent of F1 generation and 55.56 % of F2 offspring were positive for eG FP transgene under the control of EF-1 promoter via PCR analysis. The transgenic pups were generated in an injection site-and age-independent manner. The expression of transgene was displayed in the progeny derived from lentiviral vector containing CMV promoter to drive transgene, but it was silenced or undetectable in the offspring derived from lentiviral vector with transgene under EF-1 promoter. The methylation level of g DNA in the promoter region of transgene was much higher in the samples derived lentiviral vectors with EF-1 promoter than that with CMV promoter,suggesting e GFP transgene was suppressed by DNA methylation in vivo.Conclusion: This research reported here an effective strategy for generation of transgenic mice through transduction of MGSCs in vivo using lentivirus vectors with specific promoters, and the transgenic offspring were obtained in an injection site-and age-independent manner. This protocol could be applied to other animal species, leading to advancement of animal transgenesis in agricultural and biomedical fields.     

Production of Transgenic Farm Animals by Viral Vector-Mediated Gene Transfer

Transgenic technology holds considerable promise to advance understanding in biomedical and agricultural systems with some believing that one day transgenic animals may directly contribute to farming and breeding practice. Nevertheless, applications in livestock have been restricted in part by the inefficiency of the technology. The recent development of lentivirus vectors for transgene delivery may overcome some of this limitation. This presentation describes these vectors, their advantages and limitations.     

转基因动物研究进展

本文从转基因动物的产生、转基因细胞载体的运用、基因的转移、转基因的命运、转基因的载体、基因功能的研究,生物医学模型、制备重组蛋白、改善乳成分等方面综述了转基因动物的最新研究成果。     

Transgenic mouse offspring generated by ROSI

The production of transgenic animals is an important tool for experimental and applied biology. Over the years, many approaches for the production of transgenic animals have been tried, including pronuclear microinjection, sperm-mediated gene transfer, transfection of male germ cells, somatic cell nuclear transfer and the use of lentiviral vectors. In the present study, we developed a new transgene delivery approach, and we report for the first time the production of transgenic animals by co-injection of DNA and round spermatid nuclei into non-fertilized mouse oocytes (ROSI). The transgene used was a construct containing the human CMV immediate early promoter and the enhanced GFP gene. With this procedure, 12% of the live offspring we obtained carried the transgene. This efficiency of transgenic production by ROSI was similar to the efficiency by pronuclear injection or intracytoplasmic injection of male gamete nuclei (ICSI). However, ICSI required fewer embryos to produce the same number of transgenic animals. The expression of Egfp mRNA and fluorescence of EGFP were found in the majority of the organs examined in 4 transgenic lines generated by ROSI. Tissue morphology and transgene expression were not distinguishable between transgenic animals produced by ROSI or pronuclear injection. Furthermore, our results are of particular interest because they indicate that the transgene incorporation mediated by intracytoplasmic injection of male gamete nuclei is not an exclusive property of mature sperm cell nuclei with compact chromatin but it can be accomplished with immature sperm cell nuclei with decondensed chromatin as well. The present study also provides alternative procedures for transgene delivery into embryos or reconstituted oocytes.     

水牛原代体细胞慢病毒感染体系的建立

试验旨在建立水牛原代体细胞慢病毒感染体系。通过比较慢病毒（lentivirus）感染水牛颗粒细胞（buffalo granulosa cell,BuGC）、水牛乳腺上皮细胞（buffalo mammary epithelial cell,BuMEC）、水牛成纤维细胞（buffalo fibroblast cell,BuFC）的效率及荧光强度,筛选出3种水牛原代体细胞的最佳感染复数（MOI）。分离培养获得BuGC、BuMEC及BuFC。将慢病毒质粒pLVX-Puro-GFP和包装质粒pSPAX2、pMAD2.G脂质体转染HEK293T细胞,于转染后48和72 h收集病毒并通过稀释计数法测定慢病毒滴度。将慢病毒按不同的感染复数（100、200、400、600、800）感染BuGC、BuMEC和BuFC,感染72 h后于倒置荧光显微镜下观察拍照,统计感染效率及荧光强度。慢病毒感染3种水牛原代体细胞后,用嘌呤霉素筛选。结果显示,在MOI≤200时,慢病毒感染后细胞荧光强度BuMEC最强,而BuGC和BuFC间无显著差异;在MOI≥400时,慢病毒感染后细胞荧光强度为：BuMEC>BuGC>BuFC。在MOI=100时,慢病毒感染效率为：BuGC>BuMEC>BuFC;在MOI=200时,BuMEC和BuGC感染效率达到100%;在MOI=800时,BuFC感染效率达到100%。不同细胞类型对慢病毒的毒性耐受存在差异,在嘌呤霉素的筛选和维持下,获得了3种水牛原代体细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）过表达慢病毒稳转细胞株。慢病毒感染BuMEC、BuGC、BuFC的最佳MOI分别为200、400和800;3种水牛原代体细胞均能通过慢病毒获得过表达外源基因细胞株。本研究结果为水牛的乳腺组织发育分化、泌乳调控、生殖发育及转基因动物制备等提供了较好的细胞模型。     

Human gene therapy vectors derived from feline lentiviruses

Lentiviral vectors are useful for gene transfer to dividing and nondividing cells. Feline immunodeficiency virus (FIV) vectors transduce most human cell types with good efficiency and may have advantages for clinical gene therapy applications. This article reviews significant progress in the development and refinement of FIV vector systems.     

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。     

可遗传与非可遗传构件应用与转基因动物食品安全评价介绍

近年来基因工程技术不断发展,转基因生物及其产品如雨后春笋般不断涌现,随之而来的转基因食品安全问题也逐渐引起关注和重视。可遗传与非可遗传构件的应用作为生产转基因动物的方法,其存在的潜在风险与巨大的发展前景共存。作者就可遗传与非可遗传构件应用及与转基因动物食品安全评价的关系进行了介绍和讨论,并对其未来的发展做出展望。