小麦高分子量麦谷蛋白14亚基基因的花粉管通道法转化

【目的】利用优质高分子量麦谷蛋白亚基对小麦进行遗传转化和品质改良。【方法】采用花粉管通道法,将小麦高分子量麦谷蛋白14亚基基因导入洛阳8716、陕354、陕893、小偃107和陕150 5种不含该亚基的小麦品种中,转化后代在大田播种出苗后,利用小麦高分子量麦谷蛋白14亚基基因特异性引物进行PCR检测,分析其转化率。【结果】不同品种、不同处理间转化率存在很大差异,其中以陕354授粉后切去柱头,滴加50 ng/μL DNA液处理的转化率最高,为1.01%,所有转化材料的平均转化率为0.56%。【结论】利用花粉管通道法对小麦进行遗传转化是可行的。     

小麦农杆菌转化体系的优化及HMW-GS 1Bx14基因转化

以小麦绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织为材料,利用gus基因的瞬时表达,探讨了农杆菌菌株和侵染条件对转化效率的影响。结果发现,对于农杆菌菌株EHA105,小麦绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织侵染的最佳条件均为OD6000.8,侵染30min。对于农杆菌菌株LBA4404,绵阳19和洛阳8716幼胚愈伤组织侵染的最佳条件分别为OD6001.0,侵染30min和OD6000.8,侵染60min。利用建立的农杆菌转化体系对小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Bx14基因进行了转化,经潮霉素抗性筛选、PCR和PCR-Southern杂交检测,平均转化率为0.61%。     

基因枪介导的转PYL5基因小麦的获得与鉴定

【目的】通过基因枪介导共转化,获得转拟南芥抗旱基因PYL5的小麦植株,为转基因小麦的抗旱功能研究奠定基础。【方法】以小麦品种西农889、绵阳19和宁春16为供试材料,通过基因枪介导法将诱导型启动子Rd29A启动的PYL5基因和筛选标记基因Bar共转化到小麦幼胚愈伤组织中,经过除草剂PPT(Phosphinothricin)筛选和愈伤组织分化,获得再生植株。根据目标基因PYL5和Bar基因序列分别设计特异引物,对移栽成活的小麦T0代再生植株进行基因特异性PCR检测。【结果】采用基因枪分别轰击西农889的1800个、绵阳19的800个和宁春16的800个幼胚愈伤组织,经过筛选和分化分别获得了9,5和14株小麦再生植株;对转基因小麦T0代再生植株的基因特异性PCR检测结果表明,西农889、绵阳19和宁春16 Bar基因的转化率分别为0.280%,0.500%和0.750%,PYL5基因的转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%,Bar和PYL5基因的共转化率分别为0.110%,0.125%和0.500%。【结论】PYL5基因成功转入到了小麦品种西农889、绵阳19和宁春16中。     

小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析

【目的】尝试利用转基因方法提高旱稻铁含量。【方法】采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良旱稻品种“旱稻297”和“旱稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0～T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究

 【目的】尝试将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因（SacB）导入小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742以提高其耐旱性。【方法】利用农杆菌介导法转化小麦幼胚愈伤组织，将SacB基因导入4个小麦品种，并对转化植株进行PCR和Southern杂交检测。【结果】SacB基因已整合到受体小麦的基因组中。转基因植株整合目的基因的拷贝数多为1～2个。4个受体小麦品种（系）02-371、02-207、郑麦9023和东农7742的转化频率分别为0.88%、1.48%、1.04%和1.23%。RT-PCR检测结果表明，SacB基因在部分转基因植株中得到表达，并使转基因小麦植株的耐干旱胁迫能力明显提高。【结论】向小麦中导入枯草杆菌SacB基因可增强其耐旱性。     

大豆铁结合蛋白基因在早稻中的表达及铁含量分析

【目的]尝试利用转基因方法提高早稻铁含量。【方法]采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启动子GluB-1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、Southern杂交分析方法验证转化结果。【结果】转基因植株T1代RT-PCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1～T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株R～T。代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。【结论】利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。     

基因枪法将细胞周期蛋白基因CycD2导入小麦的研究

以小麦品种绵阳11作为基因枪转化的靶材料,用含有细胞周期蛋白基因CycD2和新霉素磷酸转移酶基因NPTII的质粒PBI121轰击小麦成熟胚性愈伤组织,在含有遗传霉素G418的筛选培养基对愈伤组织进行筛选后诱导得小麦再生植株,经PCR检测有4个转基因小麦植株呈阳性,South-ern-blot鉴定后进一步证明CycD2基因已经被成功导入小麦并整合到小麦基因组中。     

基因枪法获得优质HMW亚基基因表达的转基因小麦

 为探讨利用基因工程技术进行小麦品质改良的可行性,用基因枪法对湖北省3个小麦品种鄂恩1号、鄂麦11号和鄂麦12号分别进行优质高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因1Ax1和1Dx5+1Dy10的转导。试验结果表明，经基因枪轰击的幼胚外植体的再生频率和转化频率明显比幼穗高；基因型间愈伤组织再生能力和转化频率的差异，直接影响着小麦转化的成功率；3个品种的幼胚发育时期与其再生频率均呈显著负相关（r =-0.93或-0.95）；在可控环境条件下，花后12～14 d的供试植株幼胚的转化频率最高（鄂恩1号、鄂麦11号和鄂麦12号分别为4.5%、2.9%和2%）。研究表明，鄂恩1号、鄂麦11号适龄期的幼胚试材,用等摩尔比的优势亚基基因1Dx5和1Dy10与选择标记基因以2：1摩尔比混合的沉淀物包裹金粉，经600～900 psi氦气压轰击后，在含0.5 mg·L-1 2,4-D的MS培养基中诱导愈伤、含0.1 mg·L-1 2,4-D和5 mg·L-1玉米素的R培养基中分化、3mg·L-1 L-PPT选择压下继代分化筛选，可获得稳定可育的T0代转基因植株以及胚乳特异性表达的T1代转基因种子。     

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。     

多重PCR的建立及黄淮麦区主要品种品质相关基因的鉴定

 【目的】小麦加工品质由多个位点控制,而每个位点又有多个等位基因控制。建立品质性状多重PCR反应体系是提高分子标记辅助选择效率及降低成本的一种重要措施。【方法】选择影响小麦品质性状重要基因的分子标记,即高分子量谷蛋白亚基基因标记Ax2*、Bx14、Bx17和Dx5;低分子量谷蛋白亚基基因标记Glu-A3 d;糯蛋白亚基Wx-B1基因标记BDFL-BRD和Wx-D1基因标记MAG269;1BL/1RS易位标记ω-sec及多酚氧化酶（PPO）活性基因标记PPO18。根据优质面包、优质面条亚基组成要求及引物的退火温度,建立3个多重PCR反应体系PCR-Ⅰ（Ax2*/Bx17/Dx5）、PCR-Ⅱ（BDFL-BRD/MAG269/PPO18）和PCR-Ⅲ（Bx14/Glu-A3d/ω-sec）。【结果】用构建的3个多重PCR对141份黄淮麦区小麦品种加工品质相关基因的分布情况进行了检测。结果表明Ax2*、Bx14、Bx17具有较低的分布频率,分别为4.3%、7.1%、1.4%;Dx5和Glu-A3 d分布频率相对较高,分别为17.7%和27.7%;而1BL/1RS易位和低PPO活性（扩增片段为876 bp）的材料分别占44.0%和51.8%;Wx-B1缺失材料占4.3%。在供试的141份材料中已有80份进行了高、低分子量谷蛋白亚基和黑麦碱的SDS-PAGE电泳检测,与本研究建立的多重PCR检测结果完全一致。【结论】建立的多重PCR体系可以准确、稳定、高效地检测9个小麦品质性状的基因组成。     

优质面条商品小麦澳白麦相关品质基因的分子标记鉴定

【目的】鉴定澳白麦面条相关品质基因构成,为改良中国小麦面条品质提供信息。【方法】利用38个已知面条品质相关基因的功能标记,对从澳白麦群体中分离出的36个穗系的高、低分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS、LMW-GS）、1B/1R易位、Waxy蛋白亚基、多酚氧化酶（PPO）活性、黄色素含量、籽粒硬度和穗发芽（PHS）抗性等相关基因进行鉴定。【结果】共发现13个对面条品质有正向效应的基因,其中非1B/1R易位类型和HMW-GS基因Bx7频率达100%,HMW-GS基因By8、LMW-GS基因Glu-A3b和Glu-B3b分别占供试材料的88.9%、88.9%和83.3%,淀粉品质相关Wx-B1蛋白亚基缺失类型占86.1%,低PPO活性等位基因Ppo-D1a和低黄色素含量等位基因Psy-B1b类型分别占86.1%和80.6%,与软-中等籽粒硬度相关等位基因Pinb-D1a类型占97.2%,抗穗发芽Vp-1Bc型穗系占88.9%。36个穗系共包含12类不同的品质基因型,其中第2类基因型（含HMW-GS基因Bx7和By8、LMW-GS基因Glu-A3b和Glu-B3b、低PPO活性基因Ppo-D1a、低黄色素含量基因Psy-B1b、软-中等籽粒硬度基因Pinb-D1a、抗穗发芽基因Vp-1Bc,不含1B/1R易位,Wx-B1蛋白亚基缺失）频率达63.9%,含正向效应基因最多、负向效应基因最少,是决定澳白麦优良品质的主导基因型。【结论】澳白麦是一个多系混合的商品小麦,优质面条基因较全面且频率高、基因型互补是其面条品质优良的根本原因。利用澳白麦资源进行面条品质育种,其中第2类基因型可作为首选亲本材料。     

小麦Bx7亚基过量表达基因(Bx7OE)分子检测及对小麦品质影响

[目的]明确高分子亚基Bx7OE在6个品种中的分布,研究其对小麦品质影响,帮助品质性状改良。[方法]利用已有Bx7OE特异性标记,对津强1号、辽春10号及其杂交育成的5个品种进行检测,采用SDS-PAGE方法,获得7个品种高分子量亚基分布数据,并进行品质分析。[结果]7个供试品种中,有4个品种扩增出447 bp的片段,分别是津强1号、津强2号、津强5号和津强6号,说明里面含有7OE亚基。SDS-PAGE数据表明,这7个品种亚基组成为在Glu-A1位点除津强1号为2＊亚基外,其余均为1亚基,在Glu-B1和Glu-D1位点均为7＋8亚基和5＋10亚基。通过品质数据分析,Bx7OE亚基对小麦粉质指标有明显的正面影响。[结论]STS标记特异性较好,Bx7OE亚基对改良小麦品质作用较大,可用于中国小麦品质改良。     

新疆春小麦新品种(系)高分子量麦谷蛋白优质亚基分析

【目的】 研究新疆春小麦及CIMMYT引进材料的HMW-GS组成差异,为新疆春小麦杂交选配提供依据。【方法】 采用SDS-PAGE电泳技术。分析新疆春小麦192份材料中的HMW-GS的组成及分布频率。【结果】 供试材料中共检测出13种HMW-GS等位变异,Glu-A1位点等位变异Null亚基频率最高(64.06%),其次为1亚基(21.35%)和2^*亚基(14.58%)。Glu-B1 位点等位变异类型表现最丰富,其亚基频率高低顺序为7+8(39.58%)>7(17.19%)>7+9(13.54%)>17+18(11.46%)>22(9.38%)>13+16(7.29%)>6+8(1.04%)>14+15(0.52%);其中 7+8、17+18、14+15 和 13+16 亚基为优质亚基,频率为58.85%。Glu-D1 位点检测2+12(49.48%)和5+10(50.52%)频率较为接近。在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点的优质亚基比例均表现为新疆春小麦品种(系)>引进CIMMYT材料。【结论】 全部HMW-GS共形成32种亚基组合,品质评分平均分为7.04分,其中新疆春小麦近年育成的新品种(系)表现出品质评分较高平均分为8.12分,明显高于引进CIMMYT材料品质评分平均为6.09分。评分为10分的材料有25个,评分在8分以上的有90份材料。     

小麦花粉电穿孔转化因素优化和转基因植株获得及鉴定

[目的]通过优化电穿孔转化技术主要参数,得到候选转基因植株,探索普通小麦(Triticum aestivum L.)电穿孔遗传转化体系.[方法]以冬小麦品种济麦19为受体,GUS为外源基因,将扬花期成熟花粉以最适电场强度和操作温度进行电穿孔处理后,人工授粉济麦19,最终收获种子;利用PCR技术、Southern技术、化学染色方法对T1、T2植株进行鉴定.[结果]电穿孔转化以电场强度6 kV·cm-1、冰上处理花粉,花粉密度为5×106个/mL,以及去雄后第5天授粉为最佳参数;Southern杂交检测结果表明,T2阳性植株的2个株系检测到杂交信号,同时其幼根、叶片等组织经GUS表达活性的组织化学染色检测,呈现蓝色反应.[结论]利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合到小麦基因组中并稳定遗传至T2,且外源基因GUS能够得到表达.     

小麦-十倍体长穗偃麦草广谱抗锈易位系的鉴定及分析

【目的】从普通小麦与十倍体长穗偃麦草的杂交、回交后代中,获得对小麦条锈病流行混合小种具有广谱抗性的新种质。【方法】对普通小麦与十倍体长穗偃麦草的杂交、回交后代材料进行条锈病鉴定、农艺性状调查、分子细胞学和品质相关性状分析。【结果】这批材料在苗期普遍表现为轻度感病,但成株后则完全高抗或免疫,对8份材料进行了连续三年的人工接种鉴定,抗性表现十分稳定。对多种致病小种具有很好的抗性,根尖细胞染色体条数均稳定在42条,农艺性状良好。原位杂交分析显示这些材料中含有同一个易位片段,即在4DS末端有一来自长穗偃麦草St基因组的小片段易位,其中一个品系（GDR3）还携带一个未能准确定位的小片段易位,该材料对混合小种的抗性优于其它材料。推测这2个小片段易位上均含有新的抗条锈病基因。高分子量麦谷蛋白分析表明,这批材料均含有优质亚基14+15。【结论】与小麦相比,其野生近缘物种中可能含有更多的广谱抗性基因,是其在恶劣自然环境下生存的遗传基础,也为小麦抗病育种提供了新抗源。     

拔节至成熟期遮荫对小麦籽粒高分子量麦谷蛋白亚基积累及GMP含量的影响

 【目的】高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）和麦谷蛋白大聚合体（GMP）含量是反映小麦籽粒品质的重要性状,本试验研究拔节到成熟期遮荫对2个含相同HMW-GS亚基类型（7+8、2+12）小麦品种胚乳HMW-GS积累动态和GMP含量的影响。【方法】采用SDS-PAGE电泳和切胶比色的方法,对遮荫条件下小麦籽粒中HMW-GS亚基进行定量分析。【结果】遮荫使HMW-GS的起始形成时间提早,18%和25%重度遮荫处理缩短各亚基和总亚基快速积累期,并降低灌浆后期积累速度,成熟期单粒总HMW-GS积累量低于对照,但成熟期籽粒HMW-GS和GMP含量高于对照。轻度遮荫（10%）延长了籽粒HMW-GS快速积累期,亚基积累量和含量均高于对照。【结论】遮荫处理影响小麦籽粒HMW-GS积累,但其效应与遮荫强度有关。     

小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）对面条感官质量的影响

【目的】明确HMW-GS及其组合对面条感官质量特性的影响,筛选适于制作优质面条的HMW-GS及其组合。【方法】以大田种植的80份小麦品种为材料,实验室制作干白面条。采用标度感官评价方法,利用经过培训和测试的感官评价员组成的感官评价小组,对煮制后的面条进行感官质量评价。通过组间方差分析,研究Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点内单个亚基及其亚基组合对面条感官质量的影响。【结果】方差分析结果表明,Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点分别对光滑性、弹性和感官评价总分、硬度和黏性有显著影响（P＜0.1）,Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点内单个亚基对面条感官质量的影响大小为Null＞1、7+8＞7+9＞14+15、4+12＞5+10≥2+12。不同亚基组合的面条感官质量特性（色泽、硬度、弹性、光滑性）以及总分之间存在显著差异（P＜0.1）。亚基组合为Null/7+8/2+12、1/7+8/4+12、1/7+8/5+10的小麦品种制作面条的感官质量得分较高,且在部分感官质量特性方面表现突出。【结论】不同位点HMW-GS对面条感官质量有显著影响。Glu-B1位点上的7+8亚基为影响面条感官质量特性的主要亚基类型。亚基组合为Null/7+8/2+12、1/7+8/4+12和1/7+8/5+10的小麦品种制作的面条感官评分较好,为面条小麦品种选育的推荐亚基组合。     

具有优良农艺性状的小麦种质资源高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

【目的】筛选具有多个优异性状的种质资源,为广泛有效地利用这些新种质提供有用信息。【方法】以通过农艺性状综合评价筛选来的403份来自近期国家重点科技攻关获得的优良种质为材料,采用SDS-PAGE方法分析其高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成。【结果】供试材料在编码HMW-GS位点上具有较大的变异,共检测到了30个等位变异,形成64种HMW-GS组合形式。同时,在供试材料中不仅出现了“7*+9”、“2+12.2*”和“1.5*+10”等在现代小麦育种材料中的稀有亚基,而且出现了“1+2*”、“7+8+9”、“6+7+8+9”和“2+5+12”等特殊的亚基组合形式。其中有24.32%（98份）材料在Glu-1的位点具有2个优质亚基,有9.93%（40份）材料在Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1 3个位点均携带有小麦加工品质所需优质亚基。【结论】403份具有优良农艺性状的小麦种质资源在编码HMW-GS的3个基因位点上表现出丰富的多态性,共有30种HMW-GS等位变异,64种亚基组合形式;其中40份材料在Glu-1的3个位点均携带小麦加工品质所需优质亚基,值得进一步研究和利用。