菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达

甘氨酸甜菜碱是一种非毒性的渗透调节物质 ,在植物体内是以胆碱为底物 ,经两步氧化而合成的 .菠菜中 ,催化第一步反应的酶为胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase ,CMO) .为了研究胆碱单氧化酶基因的功能以及转基因植物的抗逆能力 ,在 30 0mmol L高盐浓度 (n(NaCl)∶n(CaCl2 ) =5 7∶1)的条件下 ,作者分离纯化了菠菜mRNA ,经RT PCR得到全长 (1.3kb)胆碱单氧化酶 (CMO)cDNA ,与已经报道的基因序列相比较 ,同源性为 99% .根据其核苷酸序列推导得到了氨基酸序列 .将PCR纯化产物与pET 30a+ 连接 ,构建了重组表达载体pETCMO ,并转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导获得高效表达 .     

柴达木盆地梭梭CMO基因的克隆及其蛋白结构预测

对柴达木盆地梭梭的CMO基因进行扩增,并利用生物软件对CMO基因序列进行分析、对蛋白结构进行预测。结果表明,柴达木盆地梭梭CMO基因长度为1 341 bp,编码447个氨基酸。CMO蛋白亲水性、二级结构、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋区、三级结构预测结果显示柴达木盆地梭梭CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲。CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障。此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区。柴达木盆地梭梭CMO蛋白三维结构预测结果显示CMO蛋白三维结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。     

枸杞胆碱单加氧酶基因的克隆与表达分析

根据CenBank中的植物胆碱加氧酶(CMO)基因的同源保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从枸杞中扩增出CMO基因的保守序列,并利用巢式PCR、5'-RACE和3'-RACE获得全长CMO.测序结果表明,CMO全长1540 bp,包含1284 bp长的开放读码框(ORF),编码1个含427氨基酸残基、分子量为48.48 kDa、等电点(pl)为5.97的假定蛋白质.此序列Genbank登录号为FJ514800.mRNA分析表明,CMO基因在枸杞幼苗组织中受高盐胁迫和低温胁迫的上调诱导表达,表明该基因可能在植物抵御非生物胁迫中发挥重要作用.     

干旱胁迫下沙棘CMO基因的时空表达模式与蛋白结构预测

CMO基因是沙棘体内甜菜碱合成过程中的关键性基因,对植物体抗旱起着重要作用。以青海野生中国沙棘的根、茎、叶为试验材料,对沙棘CMO基因及其全长序列进行克隆,并进行生物信息学分析,在此基础上对不同程度干旱胁迫下沙棘不同组织部位CMO基因的时空表达模式进行研究。结果表明,沙棘CMO基因全长1 566 bp, ORF长1 364 bp,编码454个氨基酸,分子量为51.41 ku,等电点为6.78;CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲;CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障;此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区;CMO蛋白三维结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲互相盘绕而成;时空表达模式研究表明沙棘CMO基因的表达明显受到干旱胁迫的影响,CMO基因的表达量随胁迫时间的延长而整体呈逐步升高的趋势,直至胁迫末期或复水后才有所降低;CMO基因在沙棘不同组织部位中的表达有一定的差异,表达量大小为根>叶>茎。通过对沙棘CMO基因的研究分析,以期为提高沙棘抗旱性及植物CMO基因的深入研究提供参考意义。     

川芎甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

以川芎(Liqusticum churning Franch Hort)为材料,采用RT-PCR和RACE方法,从新鲜的嫩叶中克隆出甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因的cDNA序列。克隆到的cDNA序列全长为2 211 bp,编码一条由508个氨基酸残基组成的多肽,其核酸序列与人参的BADH基因的cDNA序列同源性为86%,对应编码氨基酸序列同源性为91%。将得到的序列提交GenBank,序列号为HM352764。与其他植物BADH的氨基酸序列比对,川芎BADH具有相同功能区域,包括N-端信号肽、底物结合及酶催化位点,因而可以参与甜菜碱的合成反应。对川芎BADH与其他植物BADH的氨基酸序列的进化分析表明,其与五加科人参的同源性较近。     

梭梭液泡膜焦磷酸酶HaVVP基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物液泡膜焦磷酸酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到1个H+-PPase基因,命名为HaVVP。HaVVP基因编码区长2 734bp,编码767个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物H+-PPase基因核苷酸序列的同源性均在68%以上、氨基酸序列的同源性达80%以上。     

杜梨甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及非生物胁迫下的转录反应

盐胁迫是限制作物生长和产量的主要环境因素之一,它直接导致植物组织和细胞的水分丧失。为了防御细胞失水,植物积累渗透保护物质甘氨酸甜菜碱(Glycine betaine,GB)来维持植物细胞的渗透平衡[1]。植物GB合成以甜菜碱醛为底物,由甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化生成。不同植物BADH基因的mRNA转录水平均受到盐胁迫诱导上[2-5]     

植物甜菜碱合成相关酶及其基因工程研究进展

甜菜碱(Glybet)是植物体中起着无毒渗透保护作用的最主要的细胞相溶性物质,许多高等植物在干旱、盐碱和低温等不利环境下,在细胞中会积累大量甜菜碱,以维持细胞的正常膨压。综述了植物甜菜碱合成途径中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶、胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶的分子生物学特性及其基因工程研究的最新进展。     

植物磷酸乙醇胺甲基转移酶基因(PEAMT)表达特性分析

PEAMT即磷酸乙醇胺甲基转移酶,是合成磷酸胆碱的关键酶,磷酸胆碱脱磷酸后形成胆碱,胆碱经两步连续反应合成甜菜碱。甜菜碱是一种无毒的小分子渗透调节剂,可以在植物体受到外界胁迫条件下起保护作用。文章就近年来植物PEAMT基因的表达特性研究进展作了概述,该基因的表达受多种胁迫的诱导。     

甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。     

胆碱与小麦品种抗赤霉病关系的研究

测定了对赤霉病抗性不同的4个小麦品种－苏麦3号、望水白（抗病）和凡6、绵阳11号（感病）穗部器官的胆碱类物质（胆碱、甜菜碱）总含量和抽提物以及胆碱对赤霉菌生长的刺激效应。结果表明,花药、颖壳和穗轴的抽提物及胆碱对赤霉菌分生孢子萌发、芽管伸长和菌丝生长有明显刺激作用。花药中的胆碱类药物质含量显著高于颖花和穗轴中的含量。花药的胆碱类物质含量在抗感品种间无显著差别;而颖壳和穗轴中的胆碱类含量,则是感病品种高于抗病品种。因此可认为胆碱是影响小麦品种抗赤霉菌在穗部扩展的一个因素。     

茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱（GB）合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO（GenBank登录号：JX050146）的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。     

玉米高光效基因ppdk的克隆及其生物信息学分析

[目的]获得玉米(Zea mays)的丙酮酸磷酸双激酶基因(以下简称ppdk),并对其进行生物信息学分析.[方法]使用Trizol提取玉米SC704的总RNA,并用特异引物对其进行RT-PCR扩增,将得到的cDNA片段连接到pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析.[结果]获得的玉米PPDK基因CDS全长2781bp,与玉米z561ppdk基因同源性为99;;其编码的多肽链包含926个氨基酸,与玉米PPDK同源性为97;.[结论]克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,它所编码的氨基酸序列具备PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心区域.该基因的成功克隆为今后利用其改造C3植物的光合效率以提高粮食单产奠定了良好的基础.     

香菇gpd启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体的构建

根据Genbank中提交的云芝(Coriolus versicolor (L.) Quel.)漆酶(lcc1)基因cDNA序列设计引物,利用RT-PCR获得云芝漆酶基因cDNA完整编码框,与GenBank中云芝漆酶基因同源性为96%;以pCAMBIA1381xb为初始载体,利用引物两端的酶切位点,将克隆得到的云芝漆酶基因cDNA序列分别连接到香菇gpd启动子Lg1和Lg2的下游,构建成香菇启动子引导的云芝漆酶基因真核表达载体pC-XG1-YZ-Lac和pC-XG2-YZ-Lac,利用冻融法将其转到了农杆菌EHA105中.     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。     

中国大耳白肉兔IFN-γ、IL-2和IL-4基因的克隆测序与进化分析

实验应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在国内首次从ConA诱导培养的中国大耳白肉兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到IFN-γ、IL-2和IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中,经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明:①经克隆得到的IFN-γ基因(序列号:DQ852341),与Genbank中已登录的欧洲兔IFN-γ基因(序列号:AB010386)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在63.0%(鼠)～77.6%(人)之间;编码氨基酸同源性在41.7%(鼠)～65.7%(人)之间;②扩增得到的IL-2基因(序列号:DQ852342),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-2基因(序列号:AF068057)的核苷酸序列和推知氨基酸序列的同源性分别为99.6%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在64.8%(鼠)～86.0%(人)之间;编码氨基酸同源性在55.7%(鼠)～80.1%(人)之间;③扩增得到的IL-4基因(序列号:DQ852343),与Genbank中已登录的欧洲兔IL-4基因(序列号:AF169169)的核苷酸序列和推知氨基酸序列同源性均为100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、大熊猫和鼠等的核苷酸同源性在57.0%(大熊猫)～69.8%(人)之间;编码氨基酸同源性在43.0%(鼠)～53.6%(人)之间。用这3个基因分别构建的进化树结果都表明,兔与人的亲缘关系相对较近,与鼠的亲缘关系最远,这与传统的分类地位基本吻合,即兔与鼠应分别归为兔形目和啮齿目动物。