鸡卵清蛋白基因5′调控序列表达载体的构建及其在鸡原代输卵管上皮细胞及鸡成纤维细胞的表达

将氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因与鸡卵清蛋白基因上游调控序列融合，构建了pCAT-3-OVP(鸡卵清蛋白基因5′调控序列）表达载体。将构建的载体与脂质体混合后制备转染液，转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞进行瞬时表达。结果表明，在鸡原代输卵管上皮细胞，转染后48h表达量最高，为0．67μg/L;而在鸡成纤维细胞，不论有无类固醇激素存在，均不表达。结果提示，在输卵管细胞中存在细胞特异性转录因子。     

鸡输卵管生物反应器的研究进展

目前鸡输卵管生物反应器的研究集中在以卵清蛋白调控区来调控外源基因的表达。鸡输卵管生物反应器的研究以输卵管细胞的培养为起点 ,再研究外源基因在输卵管内定位表达的可能性 ,最后制作转外源基因能稳定遗传的转基因鸡。本文对鸡输卵管生物反应器研究作一综述 ,提出了存在的问题并作以展望。     

蛋鸡输卵管子宫部蛋壳钙化节律及其分子调控途径

高产蛋鸡具有近似24 h的产蛋规律(近日节律),被排出卵巢的卵在输卵管各部位具有相对固定的停留时间,其中停留于子宫部的时间最长。时钟基因是生物钟的最基本组成单位,其节律性表达预示着生物钟的存在,研究发现时钟基因调控动物繁殖周期,并且在鸡输卵管子宫部中节律性表达,输卵管子宫部是蛋壳形成的主要部位,可以推测生物钟存在于输卵管子宫部,时钟基因通过发条机制调控蛋壳形成相关离子、离子通道蛋白、离子结合蛋白、蛋壳特异性基质蛋白等下游蛋壳形成相关基因节律性表达,从而保证蛋壳按序合成和蛋鸡产蛋的连续性。     

1.1kb、2.7kb、3.0kb鸡输卵管组织特异性启动子的克隆及细胞评价

鸡卵清蛋白基因启动子是指导外源基因高效特异性表达的理想调控区,利用卵清蛋白启动子驱动外源蛋白大量表达,需要包含组织特异性相关序列。本研究以海兰白鸡的基因组为模板,采用PCR扩增了1.1 kb、2.7 kb和3.0 kb的卵清蛋白启动子区,置换pcDNA6.2-GFP中CMV启动子序列,构建了真核表达载体pOV1.1 kb-GFP、pOV2.7 kb-GFP、pOV3.0 kb-GFP;转染原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),PCR、RT-PCR证明重组载体能够整合到细胞基因组内,并进行转录;倒置荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白表达;启动子表达效率由高到低依次是CMV启动子、1.1 kb、2.7 kb、3.0 kb卵清蛋白启动子。研究结果为瞬时表达模型的建立和输卵管生物反应器的研究奠定基础。     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白（H+/myoinositol transporter，HMIT）基因的转录序列，并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况，以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物，采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列，采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性，利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况，并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明，以NCBI预测的鸡HMIT（XM_001232939.5）序列为模板设计引物，成功克隆出鸡HMIT基因（1 694 bp，GenBank登录号：MN708211）。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp，相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp，预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现，鸡HMIT在物种间高度同源，共线性分析显示，HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质，其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示，鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明，鸡HMIT蛋白分布于质膜（52.3%）、内质网（21.7%）、液泡（17.4%）、线粒体（4.3%）和高尔基体（4.3%）。实时荧光定量PCR检测结果显示，HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高，且显著高于其他组织（P<0.05）。胰岛素处理240 min后，HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组（P<0.05）。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区，生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

鸡cENS-2基因 U3-R序列的克隆分析与表达载体的构建

克隆并测序了1．2kb的鸡cENS-2（chicke nnormastem cell gene-2，cENS-2）基因3’端U3-R样结构调控序列。经序列分析和同源性比较表明，所克隆的U3-R序列包含多个转录因子结合位点如AP-1、GATA-1等，同时还包括一个重要的顺式调控元件B区，该区域在鸡正常的胚胎于细胞中有特异的增强子活性。该序列经pMD-18T载体过渡后，定向连接于切去启动子的pEGFP-N1载体的上游，构建了鸡cENS-2基因U3-R样序列调控的绿色荧光蛋白基因报告载体，为下一步对鸡胚胎于细胞（CES）细胞标记研究打下基础。     

中国环颈雉A-FABP基因cDNA部分序列测定与组织表达分析

运用RT-PCR方法从中国环颈雉的总RNA中克隆了脂肪型脂肪酸结合蛋白基因的cDNA部分序列,然后运用Real-time PCR法检测了A-FABP基因在中国环颈雉不同发育阶段、不同组织及吉林黄鸡和AA白羽肉鸡的表达情况。结果显示:中国环颈雉A-FABP基因部分cDNA序列为412 bp,与鸡、鸭的基因序列同源性较高,具有脂质运载蛋白家族结构域特征。中国环颈雉A-FABP基因在150日龄表达量最大,脂肪组织为优势表达组织,不同品种间吉林黄鸡表达量最大。中国环颈雉A-FABP基因的研究,为进一步研究中国环颈雉的生长调控和良种开发与利用提供理论依据。     

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶（hLYZ）cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。     

小鼠乳清酸蛋白上游调控序列的克隆及其指导下CAT基因在家兔乳腺中的表达

应用PCR技术，从小鼠基因组中克隆了1．6kb乳清酸蛋白(WAP)基因5’上游调控序列，经酶切和测序证实与已知序列基本一致。为了证实此调控序列能否指导外源基因在乳腺中的表达，将此序列与报告基因CAT融合，构建了pWAP—CAT—polyA乳腺定位表达载体，脂质体包裹后，经乳导管将其注入到妊娠中后期家兔乳腺中进行暂时表达。分别于家兔分娩后1—10d采奶，用ELISA检测乳汁中CAT含量。结果表明，所构建的载体在家兔乳腺中能够表达，表达水平在家兔分娩后1—5d较高。     

鸡脂蛋白酯酶基因启动子的克隆及活性分析

本文旨在研究鸡脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)启动子的结构和启动子活性。采用PCR方法扩增了鸡LPL基因5′侧翼区2kb的DNA片段,对其进行克隆、测序及序列分析后,构建了其全长及系列截断突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞(DF-1),用双荧光素酶报告系统测定了荧光素酶活性。生物信息学分析发现,鸡LPL基因启动子区存在Oct-1、GCbox、CCAAT、GATA、AP1等调控元件,在启动子-575～+137bp区域内存在一个CpG岛。报告基因分析表明,鸡LPL基因的启动子-359～+163bp区域就具有启动子活性,启动子-601～+163bp区域具有最强的启动子活性。结果显示,鸡LPL基因受多种转录因子和上游序列的调控,本研究为深入研究鸡LPL基因的表达调控机制奠定了基础。     

人CD14信号肽介导卵清蛋白在HEK293T细胞的高效表达

本试验将人CD14信号肽序列与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）基因融合,旨在提高OVA在非输卵管上皮细胞中的表达。提取鸡输卵管上皮细胞总RNA,经反转录合成的cDNA,再利用修饰的特异性引物,通过PCR从cDNA中分别扩增出5’端与人CD14信号肽序列融合和非融合的OVA基因,并将它们分别插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成表达载体pcDNA-CD14sp-OVA和pcDNA-OVA。经磷酸钙介导,将质粒转染至HEK293T细胞,使其进行表达,用鼠抗OVA单克隆抗体通过免疫印迹（Western blot）法检测OVA表达水平。结果表明:本试验扩增的OVA基因序列与GenBank中的序列（登录号NM₂05152）一致,构建的人CD14信号肽序列融合OVA基因的表达载体结构正确。经过在HEK293T细胞的表达,融合人CD14信号肽序列的重组蛋白OVA的表达水平明显得到提高。结果提示,融合人CD14信号肽序列后的重组蛋白OVA在非输卵管上皮细胞中的表达水平明显提高,为OVA基因作为DNA疫苗模式抗原的应用提供了必要的条件。     

碱性磷酸酯酶基因在鸡胚和人乳腺癌细胞中的表达

通过PCR方法从pSEAP2-control质粒获得人胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)基因,并克隆到鸡输卵管特异性表达载体(pAB-Sig-SV40)卵清蛋白基因调控区下游.pSEAP2-contro1和pAB-Sig-AP-SV40质粒转染鸡胚细胞和乳腺癌细胞(MCF-7),转染48h后以对硝基苯磷酸钠(pNPP)为底物检测PLAP的活性,结果pSEAP2-contro1在鸡胚细胞和MCF-7细胞中表达PLAP,pAB-Sig-AP-SV40在鸡胚细胞中不表达,而在MCF-7细胞中表达.说明鸡胚细胞可以表达有活性的人源糖蛋白,另外也说明在雌激素受体细胞中,鸡卵清蛋白基因启动子可启动外源基因表达.     

miR-18a-5p在鸡不同生长时期的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究miR-18a-5p在鸡不同生长时期组织表达变化规律及其生物信息学特点,本研究以苏禽3号鸡为试验动物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-18a-5p的组织表达变化。通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-18a-5p序列,利用Ensembl数据库确定miR-18a-5p在基因组中的位置,根据成熟序列构建系统进化树;使用miRmap、microT、miRanda和TargetScan网站预测miR-18a-5p靶基因,并进行GO和KEGG分析。组织表达分析结果显示,miR-18a-5p序列在鸡心脏、脾脏、肾脏和下丘脑中的表达量显著高于除大脑以外的其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄鸡心脏、脾脏、肾脏、腿肌和下丘脑中miR-18a-5p的表达量均显著上升(P<0.05)。在50种脊椎动物中共发现52条miR-18a-5p序列,几乎所有物种都只有1条成熟序列;基因定位分析发现,鸡miR-18a-5p位于1号染色体上的基因间隔区。多序列比对分析表明,不同物种miR-18a-5p的成熟序列同源性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,鸡miR-18a-5p与原鸽、斑胸草雀等其他鸟类聚为一类,这表明miR-18a-5p进化过程中是保守的。靶基因预测和功能分析发现,miR-18a-5p共有121个靶基因。GO分析结果显示,靶基因主要富集到蛋白质泛素化、细胞周期阻滞、白细胞介素-6产生的负调控等功能。KEGG 通路分析表明,靶基因主要富集到细胞周期及Wnt和FoxO信号通路等。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上。综上,鸡miR-18a-5p是组织广泛表达的miRNA,其可能通过Wnt及FoxO信号通路调控肌肉生长及细胞增殖分化。本研究为miR-18a-5p功能及调控机制的深入研究提供参考依据。     

鸡U6核内小RNA基因的克隆与分析

本研究旨在获得鸡U6 snRNA的全序列,并对其序列、启动子及拷贝数等进行分析。本实验通过RT-PCR、克隆、测序获得了鸡U6 snRNA的部分序列(94 bp)。根据测序结果和鸡全基因组序列数据,结合生物信息学分析,结果获得了鸡U6 snRNA的全长序列(106 bp),该序列与人U6 snRNA序列相似性为100%,在鸡基因组中有4个拷贝,其中3个成簇存在于28号染色体上一段2 kb长的DNA片段上;另一个位于18号染色体。已有研究报道,这4个基因拷贝的5′侧翼区均具有启动子活性,说明它们是真基因。结果表明:这4个U6 snRNA基因启动子区均含有潜在的远端序列元件(DSE)、近端序列元件(PSE)和TATA box等RNA聚合酶Ш启动子元件。本研究成功获得了鸡U6 snRNA的全长序列,为选用U6基因作为内参基因开展鸡miRNA定量表达分析以及鸡U6基因的转录调控研究奠定基础。     

京海黄鸡G蛋白偶联受体1基因生物信息学及组织表达分析

试验旨在研究参与激素调节并调控卵巢功能的可能基因,挑选候选基因G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1）,深入研究其是否参与激素调节。根据转录组测序获得的京海黄鸡GPR1基因的CDS序列设计一对引物,利用实时荧光定量RT-PCR方法,检测GPR1基因在高、低产京海黄鸡卵巢组织中的表达情况,并与生物信息学进行关联,使用多种生物软件和在线工具对目的序列进行生物信息学分析,分析GPR1基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、蛋白质序列的跨膜区、亚细胞定位、亲水性、潜在的磷酸化位点、保守结构域及该基因所编码蛋白质的二、三级结构。结果显示,京海黄鸡与GenBank中原鸡、人、牛、野猪、黑猩猩、家兔、马、绵羊、藏羚羊、大鼠、小鼠、斑马鱼的同源性分别为100.0%、69.0%、69.1%、69.3%、68.9%、69.6%、69.2%、68.8%、68.9%、67.5%、69.0%和50.3%;氨基酸分析发现GPR1蛋白为疏水性蛋白,分子质量为40.41 ku,理论等电点为6.91,为7次跨膜蛋白;亚细胞定位显示,该蛋白属于非分泌蛋白;预测该蛋白含有25个潜在的磷酸化位点,1糖基化位点;二级结构以无规则卷曲为主,三级结构为7次跨膜螺旋结构;组织表达分析显示,GPR1基因在低产组的表达情况极显著高于高产组（P<0.01）。本试验结果将有利于GPR1基因功能的进一步分析,为研究该基因对京海黄鸡产蛋性状的调控机理提供理论依据。     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白(H+/myoinositol transporter,HMIT)基因的转录序列,并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况,以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物,采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列,采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性,利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况,并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明,以NCBI预测的鸡HMIT(XM_001232939.5)序列为模板设计引物,成功克隆出鸡HMIT基因(1 694 bp,GenBank登录号:MN708211)。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp,相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp,预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现,鸡HMIT在物种间高度同源,共线性分析显示,HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质,其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示,鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,鸡HMIT蛋白分布于质膜(52.3%)、内质网(21.7%)、液泡(17.4%)、线粒体(4.3%)和高尔基体(4.3%)。实时荧光定量PCR检测结果显示,HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高,且显著高于其他组织(P0.05)。胰岛素处理240 min后,HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组(P0.05)。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区,生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

鸡卵清蛋白基因上游调控序列的克隆及序列分析

应用PCR 技术从鸡肝脏基因组中克隆了1.1 kb 的鸡卵清蛋白基因上游调控序列,并进行了序列分析。结果发现,扩增产物只有2 个碱基发生了突变,其TATA 框、组织特异性因子和卵清蛋白上游启动子均未发生变异,表明已成功地克隆了鸡卵清蛋白基因上游调控序列,这为应用卵清蛋白提取生物活性物质的转基因鸡的构建研究奠定了基础。     

广西麻鸡CALM1基因的克隆、序列分析和组织表达谱研究

为分析广西麻鸡CALM1基因的编码区序列及其表达规律,克隆了广西麻鸡CALM1基因编码区序列并进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR技术检测产蛋期麻鸡在不同组织中CALM1基因的相对表达量。结果表明:广西麻鸡CALM1基因的编码区长度为450 bp,共编码149个氨基酸。与参考序列相比,起始密码子和终止密码子略有差异,不影响表达,另外存在2处错义突变(组氨酸突变为精氨酸,苏氨酸突变成为丙氨酸);物种间的同源性分析显示,广西麻鸡基因与原鸡(Gallus gallus)、普通猪(Susscrofa)、奶牛(Bos taurus)、裸鼹鼠(Heterocephalus glaber)、人类(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、苏门答腊猩猩(Pongo abelii)、褐家鼠(Rattus norvegicus)的序列同源性分别为98.7%、89.4%、84.3%、89.8%、90.0%、86.7%、89.8%、90.0%、86.7%;进化树分析显示,广西麻鸡与原鸡亲缘关系最近,与奶牛和小鼠的亲缘关系最远。产蛋期CALM1的表达谱显示,CALM1基因在脑、胸肌、脾脏中高表达,在输卵管漏斗部和膨大部、心脏、腿肌、肺、肠中中度表达,而在皮肤、肝脏、卵巢、输卵管的峡部、子宫、肾脏低表达。研究结果为进一步研究鸡CALM1基因调控广西麻鸡繁殖功能奠定理论基础。     

武定鸡GnIH基因克隆、表达及生物信息学分析

为揭示武定鸡促性腺激素抑制激素(GnIH)基因在繁殖调控阶段的分子机理,研究采用RT-PCR法克隆了武定鸡GnIH基因的编码区序列,并利用生物信息学方法对武定鸡GnIH基因编码产物的理化特性及结构与功能进行了初步分析,采用实时荧光定量PCR分析其表达情况。结果显示,获得的武定鸡GnIH基因编码区全长为522 bp,编码173个氨基酸。生物信息学预测显示,武定鸡GnIH含有一个N端信号肽;该蛋白含有5种功能活性位点;二级结构主要由无规则卷曲和α螺旋构成,分别占41.04%和36.99%。氨基酸序列比对显示,武定鸡GnIH与其他禽类的同源性在67.6%以上。荧光定量结果显示,该基因在视神经叶和垂体组织中表达量最高。研究结果为鸡繁殖性能的研究奠定了基础。     

杏花鸡白细胞介素10(IL--10)基因的克隆及其表达分析

为研究杏花鸡白细胞介素10(IL-10)基因在抵抗鸡球虫病中的作用,应用PCR、基因克隆和测序等技术获得杏花鸡完整的IL-10基因CDS序列,进行杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与其他物种间的同源性分析,比较在QM-7成肌细胞、鸡肠上皮细胞IEC、鸡巨噬细胞HD11和鸡成纤维细胞DF-1中IL-10基因的表达差异以及在不同肠道组织中IL-10的表达量差异。结果表明,完整地扩增了IL-10基因的完整CDS序列,发现了3个同义突变(162AG、180TC和303CT)。构建的发育树表明杏花鸡IL-10基因CDS序列和核苷酸序列与红色原鸡、鹌鹑、火鸡和珍珠鸡的同源性最高。IL-10在鸡肠上皮细胞的表达量最高,在盲肠扁桃体中表达量最高。球虫子孢子的入侵导致DF-1细胞和HD11细胞中的IL-10表达量升高。研究结果为IL-10基因在肠道免疫和抵抗球虫病的研究提供理论基础。