阿克苏地区枣黑斑病菌 PCR 检测方法的建立与应用

【目的】建立枣黑斑病菌的分子检测方法,研究枣黑斑病菌田间侵染动态,分析病害防治的最佳时间,为枣黑斑病的高效防治奠定基础。【方法】利用文献公布的枣黑斑病菌(Alternaria alternata) HSP70序列特异性引物,通过PCR技术进行引物特异性验证与灵敏度检测,优化反应体系,建立病原菌分子检测技术,并应用该技术确定枣黑斑病菌侵染动态监测和越冬场所。【结果】该检测技术对枣黑斑病菌的检测的最低浓度为4.886 pg/μL,可在病害症状未显症之前检测到病原菌,对病原菌的越冬场所进行检测与验证病果、病叶及冠下表层土壤是枣黑斑病菌越冬的主要场所。【结论】建立的枣黑斑病菌检测技术能够快速准确的检测和鉴定病原菌,可应用于枣黑斑病菌田间侵染动态和越冬场所的监测与验证,为阿克苏地区枣黑斑病的流行监测和早期防治提供了技术支持。     

辣椒土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用

【目的】建立简便、快速、准确同时检测辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、白绢病菌（Sclerotium rolfsii）和青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的多重PCR检测体系,为辣椒多种土传病害同时早期诊断提供技术支撑。【方法】以3种辣椒土传病害病原菌辣椒疫霉、白绢病菌和青枯病菌为研究对象,参考相关文献筛选出3种病原菌的3对特异性引物PCA1F/PCA1R、SCR-F/SCR-R和RalfliC-F/RalfliC-R,以引物浓度、退火温度、循环次数及延伸时间为变异因子,探索最佳反应体系,建立三重PCR检测方法,并基于田间实际发病样品对方法进行验证。【结果】优化的三重PCR反应体系25.0 μL: 3对引物PCA1F/PCA1R、SCR-F/SCR-R和RalfliC-F/RalfliC-R浓度分别为0.24、0.24和0.28 μmol/L,DNA模板各10 ng,2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL,ddH₂O补足至25.0 μL。最佳扩增程序: 94℃预变性1 min; 94℃ 30 s,55.8℃ 30 s,72℃ 45 s,进行35个循环; 72℃延伸10 min。建立的三重PCR体系可分别扩增出352、540和724 bp的特异性目的片段,体系灵敏度达10-1 ng/μL。利用建立的反应体系,对来自江西省不同市（县）的54份辣椒和土壤样品进行检测,样品检出率为100%。【结论】建立的三重PCR检测体系可对辣椒田间发病植株和土壤中辣椒疫霉、白绢病菌和青枯病菌进行快速、准确检测,可应用于辣椒多种土传病害并发的早期预防和流行监测。     

猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的荧光定量PCR检测方法优化

该实验从引物浓度和退火温度2个方面对荧光定量PCR方法检测猕猴桃溃疡病病原菌方法进行了优化,并应用于染病样品的检测。结果显示,10μM引物浓度、58℃退火温度为最适条件;优化后的方法能检测出猕猴桃溃疡病染病枝条,特异性较高,稳定性较好。优化后的荧光定量PCR方法可用于猕猴桃栽培中溃疡病菌的快速准确检验。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

七叶树溃疡病病原真菌的分离与鉴别

【目的】分离和鉴别引起七叶树溃疡病的病原菌,为制定合理的防治技术提供依据。【方法】采用组织分离培养、人工接种、形态观察及核糖体转录间隔区序列(ITS-rDNA)分析,对引起七叶树溃疡病的水渍型溃疡病病原菌NW397和干腐型溃疡病病原菌NW3362种真菌进行鉴别与比较。【结果】引起七叶树溃疡病的病原为2种不同的真菌,并表现出不同的危害特征。水渍型溃疡病菌NW397 ITS-rDNA序列与多主葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea Sacc.)等的序列同源性高达99%;干腐型溃疡病菌NW336ITS-rDNA序列与乌饭树拟茎点菌(Phomopsisvaccinii)等的同源性高达95%以上。【结论】七叶树水渍型溃疡病菌定名为多主葡萄座腔菌(Botryosphaeria do-thidea Sacc.),干腐型溃疡病菌定名为梨干枯拟茎点菌(Phompsis fukushii Tanaka et Mill)。     

斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列,设计3对特异性引物,优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法,对其特异性和灵敏度进行考察,并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重PCR方法,当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0,1.0和0.5μmol/L,退火温度为59.5℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091,262和450bp的目的片段,从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段,而对其他对照组的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,建立的多重PCR最低可分别检测出200CFU/mL的嗜水气单胞菌、300CFU/mL的维氏气单胞菌和200CFU/mL的鮰爱德华菌;对临床样本的检出率为100%,与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速,可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌,也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。     

黑李溃疡病病原菌的分离与鉴定

黑李溃疡病为近年来发生在浙江省黑李产区的一种严重病害,主要危害李树当年生、多年生枝和主干,引起枝条枯死和整株死亡,继而毁灭整个黑李果园。通过对黑李溃疡病典型症状样本的采集、病原菌的分离、纯化和致病性测定,明确引起该病的病原菌为一种细菌。通过对黑李溃疡病菌的菌体形态和培养特性观察,生理生化反应、脂肪酸分析、16S rDNA序列分析和种的特异性引物的检测分析,证明该病原细菌为树生黄单胞菌李变种Xanthomonas arboricola pv. pruni(Smith)Vauterin et al.。     

贵州省火龙果溃疡病病原菌鉴定及生物学特性

【目的】火龙果溃疡病是火龙果上发生最为严重的病害之一,对贵州省火龙果溃疡病的病原进行鉴定及生物学特性研究,为防治贵州省火龙果溃疡病提供理论基础。【方法】采用组织分离法、形态学观察以及分子生物学等方法对贵州火龙果溃疡病病原进行分离鉴定,并采用菌丝生长速率法及Biolog表型芯片技术研究病原菌生物学特性。【结果】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）;病原菌适宜生长温度为20~35℃,最佳生长温度为28℃,最适pH为6～7;光照对菌丝生长有抑制作用,短时间的紫外光照射对病原菌生长有促进作用。火龙果溃疡病菌对PMl、PM2微孔板中190种碳源物质利用率为18.42%,对PM3微孔板中95种氮源物质的利用率为52.63%。【结论】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢（Neoscytalidium dimidiatum）,病原菌较耐高温,生长环境偏酸性。研究结果对贵州火龙果溃疡病的防治及病原菌的碳氮源代谢研究奠定了理论基础。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

苹果黑星病菌的分子检测

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL引物320A/320B(10μmol/L),0.5μL聚合酶(5U/μL),1μL模版DNA(30ng/μL),加ddH2O至总体积25μL;反应程序为:94℃3min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min。利用该对特异性引物对包括苹果黑星病菌在内的26个苹果病原菌菌株基因组DNA进行的PCR扩增表明,只有苹果黑星病菌能扩增到1条约320bp的特异性条带,其他菌株及阴性对照的扩增产物均未检测到特异性条带。对接种苹果黑星病菌的苹果组织的检测表明,该对引物能特异性地检测到苹果黑星病菌的存在,其对苹果黑星病菌基因组DNA检测的灵敏度为100fp/μL。【结论】利用设计的特异性引物320A/320B,参考正交试验优化的体系和程序,结合简单的SDS法提取苹果黑星病菌基因组DNA,在1个工作日内即可完成对该病原菌的分子检测。     

柑橘溃疡病菌环介导等温扩增快速检测技术研究

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测已用于基层植物检验检疫中的疑似样品检测诊断。柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)是重要的检疫性病害,根据柑橘溃疡病菌基因组中一段保守序列设计LAMP引物,建立了柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法。该LAMP检测方法只对柑橘溃疡病菌DNA和柑橘溃疡病病斑总DNA进行扩增,而对非靶标菌DNA和非靶标病斑总DNA不发生扩增,特异性与PCR一致。该LAMP检测方法最低可检出100 pg的纯柑橘溃疡病菌DNA和最低每微升4个细菌,灵敏度均比PCR高了1 250倍。LAMP检测法能很好地区分症状极易混淆的柑橘溃疡病和疮痂病。该试验建立的柑橘溃疡病菌LAMP检测方法具有简单、快速、灵敏和特异等优点,可在条件相对简陋的实验室应用。     

柑橘溃疡病菌PCR快速检测技术研究初报

应用柑橘溃疡病菌独有的保守基因设计并合成了引物对,建立柑橘溃疡病菌PCR检测技术.PCR检测结果表明,来源于不同产地的病菌菌株均可扩增出靶标带,而水稻白叶枯病菌不能扩增出靶标带;2×10~2×105 个·ml-1的溃疡病病菌悬浮液也均可扩增出靶标带,说明该PCR技术具有很强的特异性和检测灵敏度.研究结果也表明,来源于福建、四川和安徽的柑橘溃疡病菌具有同源性.     

河南省番茄溃疡病的发现与分子确诊

2009 - 04在河南省中牟县番茄保护地内发现疑似番茄溃疡病病株,对来自发病植株及其根围土壤的20种细菌性分离物进行了生理生化特征、致病性测定及形态学特征分析,初步确定其中出现最频繁的一种分离物J16为番茄溃疡病菌,将其人工接种时能够诱发出溃疡病症状.利用番茄溃疡病菌的16S-23S rDNA ITS序列特异性引物(...     

应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。     

应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。     

生姜青枯病病原菌的鉴定与PCR检测方法的建立

青枯病是一种严重危害生姜种植的毁灭性土传细菌病害,明确引起生姜青枯病的病原菌并对其进行快速检测,对生姜青枯病早期诊断与有效防控具有重要意义.本研究采用组织分离法,对湖北省恩施生姜病样上的病菌进行分离纯化,通过形态学特征、致病性测定和分子生物学的方法对其进行鉴定;筛选并验证了生姜青枯病菌的特异性引物,优化生姜青枯病病原菌的PCR检测方法,并对该方法进行特异性和灵敏度验证,运用该方法对生姜植株和土壤的病原菌进行检测.结果表明,试验分离纯化得到了10株培养性状一致的菌株,从形态学特征、致病性测定和分子生物学方面,将代表菌株ES202023鉴定为青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum);引物21F/21R从所获菌株中扩增出长度为125 bp的特异性目的条带;通过优化后的PCR体系(25μL:2×Taq Master PCR Mix 12.5μL, 21F/21R 0.5μL,退火温度61.1℃, 30个循环),使病原菌的检测灵敏度达到10~(-2) ng/μL,且可以在感病植株及土壤中检测到病原菌.本研究建立的特异性PCR快速检测方法,对生姜青枯病的田间早期预警、姜种带菌检测和绿色防控具有指导作用.     

葡萄霜霉病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

【目的】葡萄霜霉病是葡萄生产上重要的单年流行病害,研究旨在构建葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测体系,为葡萄霜霉病的早期诊断和预测预报提供依据。【方法】依据GenBank中葡萄霜霉病菌cox2基因序列设计1对特异性引物（F-cox-Pv/R-Pv）,建立并优化常规PCR和real-time PCR反应体系,利用葡萄霜霉病菌、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄白粉病菌（Uncinula necator）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、葡萄溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae)、辣椒炭疽病菌（C. capsica）、甘草根腐病菌（Fusarium solani）、西葫芦白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）、番茄菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、马铃薯干腐病菌（F. equiseti）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）等14种葡萄及其他作物病原菌和拮抗菌的菌丝DNA进行常规PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度和可重复性进行评价。运用已构建的real-time PCR体系对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行定量检测,利用SPSS 19.0软件分析接种时间与叶片内葡萄霜霉病菌潜伏侵染量的关系。【结果】研究设计的引物特异性高,常规PCR仅对葡萄霜霉病菌DNA有扩增条带,为139 bp;real-time PCR检测结果表明该对引物对葡萄霜霉病菌有唯一的产物吸收峰,对其他供试菌株均未检测到产物吸收峰。常规PCR检测的灵敏度为10 pg·μL ^-1,real-time PCR的灵敏度可达到0.1 pg·μL ^-1,是常规PCR检测灵敏度的100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建real-time PCR循环阈值（Ct）与模板浓度的线性关系,标准曲线y=42.27-3.36x,相关系数R ²=0.997,扩增效率为98.50%,线性范围达7个数量级,在2.4×10 ³—2.4×10 ⁹ copies/μL呈现良好的线性关系。对人工接种葡萄霜霉病菌的潜育期叶片内病原菌DNA进行real-time PCR检测,结果表明叶片内病原菌潜伏侵染量随接种时间的变化呈指数关系增长,y=6.34×10 ⁴·e ^{0.084 x},相关系数R ²=0.936。该real-time PCR检测体系在接种6 h后就可以检测到葡萄霜霉病菌DNA,检测量为5.68×10 ⁴ copies/μL病原菌DNA。 【结论】构建的葡萄霜霉病菌real-time PCR检测体系的灵敏度远高于常规PCR,且特异性强、重复性好,其Ct值与模板浓度呈较好的线性关系,扩增效率高,可用于定量检测葡萄霜霉病菌的潜伏侵染量。     

菜豆普通细菌性疫病病原菌鉴定

【目的】明确中国北方地区菜豆普通细菌性疫病病原菌。【方法】应用菌落特征、油菜黄单胞菌菜豆变种诊断试剂检测、致病性测定、16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析、特异PCR检测、脂肪酸分析及生理生化反应特征对病原菌分离物进行鉴定。【结果】从病害样品和菜豆种子样品中均分离到类似黄单胞杆菌的细菌分离物,选取25个代表分离物进行致病性测定,有24个分离物在菜豆品种“英国红”上导致典型菜豆普通细菌性疫病症状。结合16S rDNA及16S-23S rDNA ITS序列比对分析、特异性PCR检测及生理生化反应的结果,24个分离物中7株被鉴定为地毯草黄单胞菌菜豆变种,17株为褐色黄单胞菌褐色亚种。【结论】中国北方地区发生的菜豆普通细菌性疫病由地毯草黄单胞菌菜豆变种或（和）褐色黄单胞菌褐色亚种引起;褐色黄单胞菌褐色亚种在中国属首次报道。     

贵州火龙果溃疡病病原菌鉴定及生物学特性

【目的】对贵州省火龙果溃疡病的病原进行鉴定及生物学特性研究,为贵州火龙果溃疡病的防治及病原菌的碳氮源代谢研究奠定理论基础。【方法】采用组织分离法、形态学观察以及分子生物学等方法对贵州火龙果溃疡病病原进行分离鉴定,并采用菌丝生长速率法及Biolog表型芯片技术研究病原菌生物学特性。【结果】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum);病原菌适宜生长温度为20～35℃,最佳生长温度为28℃,最适pH为6～7;光照对菌丝生长有抑制作用,短时间的紫外光照射对病原菌生长有促进作用。火龙果溃疡病菌对PMl、PM2微孔板中190种碳源物质利用率为18.42%,对PM3微孔板中95种氮源物质的利用率为52.63%。【结论】贵州火龙果溃疡病病菌为新暗色柱节孢(Neoscytalidium dimidiatum),病原菌较耐高温,生长环境偏酸性。