仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究V.疫苗的制备、检验和田间试验

将试验确定的产毒力强的产气荚膜梭菌A型、C型菌种,选用复合培养基,经培养、灭活脱毒、浓缩和冷冻干燥,制备多批肠毒血症A型、C型和AC型二价干粉灭活疫苗.采用免疫攻毒或中和试验方法对研制的疫苗进行效力检验,疫苗100%合格,达到<规程>规定的标准.在13个省进行大规模田间试验的结果表明,所研制的疫苗性能良好,安全有效.母猪接种疫苗后无一例不良反应发生,并且仔猪生后健康,能够有效地预防和控制该病的发生和流行.     

仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用

为了研制仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗,将大肠埃希菌C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)菌株和C型产气荚膜梭菌C59-2菌株分别接种适宜培养基,提取大肠埃希菌纤毛和C型产气荚膜梭菌外毒素,灭活和脱毒后加入冻干保护剂,冷冻干燥制成冻干灭活疫苗。该疫苗性状为类白色海绵状疏松团块,无菌检验合格,疫苗对仔猪和怀孕母猪安全,怀孕母猪免疫该疫苗后所产仔猪对大肠埃希菌和C型产气荚膜梭菌的攻毒保护率均在80%以上。临床应用结果表明,该疫苗能明显提高免疫母猪的窝平仔猪成活数。     

D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的研制及保护效果的评价

为研制更有效的预防家畜D型产气荚膜梭菌肠毒血症的疫苗,本研究采用D型产气荚膜梭菌标准菌株增菌培养,经自制产毒培养基高效产毒,制备成D型产气荚膜梭菌氢氧化铝类毒素疫苗和白油类毒素疫苗。通过不同剂量疫苗免疫绵羊的攻毒保护试验和免疫绵羊的抗体水平监测,评估疫苗的免疫保护效果。结果表明:D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗安全性良好,氢氧化铝苗和白油苗对绵羊有效免疫剂量均为4 m L(外毒素对小鼠半数致死量为2-6.4/m L),绵羊接种一个有效免疫剂量后,氢氧化铝疫苗免疫保护周期为6周以上;白油疫苗免疫保护周期为21周以上。本研究结果表明两种疫苗均具有良好的应用前景。     

产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型疫苗免疫对母猪繁殖性能及仔猪母源抗体水平的影响

为了解接种猪圆环病毒2型(PCV-2)疫苗对母猪繁殖性能及其仔猪母源抗体水平的影响,通过对合肥某猪场640头母猪的PCV-2疫苗免疫,统计其免疫前与免疫后各1年的繁殖性能数据,并分析其繁殖性能的差异,同时采用ELISA和PCR方法检测4头免疫母猪所产仔猪不同日龄血清中PCV-2抗体及其核酸。母猪PCV-2疫苗免疫后与免疫前的繁殖性能进行比较显示,窝产仔数和窝产活仔数分别增加0.36头和0.43头,差异极显著(P<0.01);窝产弱仔数减少0.11头,差异显著(P<0.05);仔猪吮初乳后10日龄时抗体水平高于其他检测日龄,至30日龄时迅速下降,之后随着日龄增长母源抗体逐渐下降,各组试验仔猪均未检测到PCV-2核酸。表明母猪接种PCV-2疫苗能显著提高母猪的繁殖性能,并能降低所产仔猪的PCV-2感染,仔猪20日龄左右首免PCV-2疫苗最佳。     

猪瘟兔化弱毒疫苗胎盘传递感染试验

对怀孕40～54天16头和怀孕65～92天28头经产母猪以4头份猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫接种。44头母猪都正常分娩,所产仔猪在两个月内生长发育正常。从免疫母猪所产29窝仔猪中各抽取2头,取其脾脏,用生理盐水制成1:10乳剂,每窝仔猪脾乳剂注射家兔2～4只进行疫苗株回收试验。结果,从怀孕40～54天接苗组的一窝仔猪脾乳剂中回收到疫苗株。     

用老龄母猪血清防治同场仔猪“三痢”的试验

由C型产气荚膜梭菌引起的新生仔猪红痢和致病性大肠杆菌引发的仔猪黄痢、白痢总称为仔猪“三痢”。笔者在有关文献的启示下，用本场产多胎老龄母猪血清防治本场母猪所产仔猪“三痢”病的试验，并用同样方法在多个养猪场和养猪大户应用，均取得了较满意的效果。     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究Ⅳ.肠毒血症C型疫苗生产用菌种的确定

试验证明用单一菌株C59-2生产C型产气荚膜梭菌肠毒血症干粉灭活疫苗,其效力可以达到<规程>要求,并且简化了生产工艺,降低了生产成本,提高了生产效率.疫苗免疫的兔血清可分别中和原来3个制苗用菌株所产生的外毒素.     

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示：制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F...     

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差...     

猪瘟兔化弱毒疫苗胎盘传递感染试验

对怀孕40－54天16头和怀孕65－92天28头经产母猪以4头份猪瘟兔化弱毒疫苗进行免疫接种。44头母猪都正常分娩，所产仔猪在两个月内生长发育正常，从免疫猪所产29窝仔猪中各抽取2头，取其脾脏，用生理盐水制成1：10乳剂，每窝仔猪脾乳剂注射家兔2－4只进行疫苗 回收试验，结果，从怀孕40－54天接苗组的一窝仔猪脾乳剂中回收到疫苗株。     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究IV．肠毒血症C型疫苗生产用菌种的确定

试验证明用单一菌株C59-2生产C型产气荚膜梭菌肠毒血症干粉灭活疫苗,其效力可以达到《规程》要求,并且简化了生产工艺,降低了生产成本,提高了生产效率。疫苗免疫的兔血清可分别中和原来3个制苗用菌株所产生的外毒素。     

两种猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗产前免疫母猪对仔猪抗体水平的影响

试验选择广东某规模化猪场怀孕母猪30头及其所产仔猪30头用进口猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗(B苗)和国产猪伪狂犬病病毒基因缺失疫苗(A苗)进行免疫试验.结果表明:各组母猪产前10 天免疫接种后20～30 d的母猪抗体水平接近或达到峰值,其所产仔猪10～60 d获得的母体抗体恰巧达到最佳.根据母猪产仔时抗体水平及其后代母源抗体维持时间的关系,建议母猪产前20～30 d为猪伪狂犬病病毒加强免疫接种的适宜时间,仔猪60日龄为适宜的首免时间;使用B苗和A苗免疫对母猪产前免疫是必要的,有利于控制带毒母猪猪伪狂犬病病毒野毒的排放,降低感染其他猪只的机会,提高仔猪保护率.     

两种猪圆环病毒2型疫苗临床免疫效果的比较

选取国内商业PCV2疫苗A和B,在一个大型猪场进行小型田间试验.将36头母猪随机平均分成3组,每组母猪所产仔猪在14日龄分别接种疫苗A(A组)、 疫苗B(B组)、 生理盐水(C组,对照).采集免疫后不同时间的仔猪血清,检测PCV2抗体,比较各组的发病率、 死亡率与增重.结果显示,接种疫苗组与对照组的仔猪发病率与死亡率都低、 且无差异;但接种PCV2疫苗的两组都显著(P<0.05)提高了增重,并改善了血清中PCV2抗体变化趋势.另外,A组的临床数据稍优于B组.检测结果表明,仔猪免疫PCV2疫苗的临床效果明显优于未免疫组,PCV2疫苗A的临床免疫效果稍好于疫苗B,为试验猪场今后进行PCV2疫苗免疫提供了实验依据.     

三价口蹄疫灭活疫苗免疫猪后免疫效果监测

为了应对现在可能出现的A型口蹄疫疫情,本试验对口蹄疫A型、O型和亚洲1型三价灭活疫苗在猪上的使用情况进行了验证,选取了45日龄左右的仔猪36头,妊娠母猪5头,进行了疫苗免疫,并定期监测其O型、A型抗体水平,免疫后30 d仔猪O型、A型抗体水平合格率均能达到80%以上,二次免疫后可达100%,妊娠母猪免疫后O型、A型抗体水平合格率均能达到100%,所产仔猪14 d的O型抗体水平合格率也可以达到85%。     

两种仔猪大肠杆菌疫苗免疫效果试验

试验采用来自不同产地的两种仔猪大肠杆菌疫苗分别对两组同期配种母猪在产前 1 5～ 2 0 d进行肌注免疫 ,观察两组 1 0日龄内仔猪腹泻及死亡情况。结果表明 :浙江康脉生物技术有限公司生产的仔猪黄痢疫苗 (母猪用 )保护率达 93.0 5 % ,辽宁某生物制品厂生产的仔猪大肠杆菌基因工程灭活苗的保护率为 80 .91 % ,二者相比 ,前者保护率高 1 2 .1 4个百分点 ,差异显著 (P<0 .0 5 )。     

OEPR法构建mETX-mCPA表达质粒及其重组蛋白的免疫效果评价

为了确定产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)和α毒素(CPA)无毒突变体作为亚单位疫苗同时预防D型和A型产气荚膜梭菌病的免疫效果,试验用点突变结合OEPR法构建重组质粒pET32a-mETX-mCPA。将阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,以预先添加乳糖的自诱导培养基表达目的蛋白。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白相对分子质量约为92 000,与预期值一致。Western blot检测结果表明,重组蛋白可被A型产气荚膜梭菌阳性血清所识别。致死性试验结果表明,重组蛋白不致死小鼠。以铝胶为佐剂将重组蛋白免疫家兔,二免血清0.1 mL可分别中和3个小鼠MLD的A型毒素和100个小鼠MLD的D型毒素。本研究用OEPR法成功构建了无毒突变体pET32a-mETX-mCPA质粒,获得的重组蛋白在家兔上显示出良好的免疫效果,为研发A、D型产气荚膜梭菌二价亚单位疫苗奠定理论基础。     

某规模化生猪养殖场种猪猪瘟抗体水平和仔猪母源抗体消退情况的检测分析

调查某规模化生猪养殖场种猪猪瘟抗体水平和仔猪母源抗体消退情况,为评估猪瘟疫苗的免疫效果和确定仔猪猪瘟疫苗的首免日龄提供科学参考。本试验使用猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒对某规模化生猪养殖场种猪及3头抗体水平合格母猪所产并且未经过猪瘟疫苗免疫的仔猪进行抗体检测。结果显示:公猪和后备母猪的猪瘟抗体合格率均为100%;经产母猪的猪瘟抗体合格率为98%。5、10、15、20、25、30、35、40日龄仔猪抗体合格率分别为100%、100%、100%、100%、100%、96%、68%、20%。根据母源抗体的消退情况,仔猪猪瘟的最佳首免时间为35日龄。     

猪口蹄疫和猪瘟疫苗同时注射免疫试验技术报告

本文在研究仔猪口蹄疫母源抗体消长规律和仔猪口蹄疫免疫效果的基础上,探讨了口蹄疫疫苗和猪瘟疫苗不同组合免疫的相互影响。结果表明:未吃初乳前的新生仔猪体内口蹄疫母源抗体效价<5log2,仔猪吃初乳后,其抗体水平与母猪相当(100%),此后从第7天开始下降,到35日龄时,其O型抗体效价下降到80%。仔猪断奶后阉割时免疫注射口蹄疫二价苗,到注射后28天,O型抗体的效价才达到(≥5log2)27.78%,亚I型抗体效价(≥1:22-90)29.73%。在60日龄加强免疫口蹄疫苗后才能使抗体效价达到70%以上。在仔猪阉割时,同时分点注射口蹄疫二价苗和猪瘟苗,或者口蹄疫O型灭活苗和猪瘟苗,此二种组合与单独注射口蹄疫疫苗相比所产生的口蹄疫抗体效价在生物统计分析上没有差异。在仔猪阉割时注射口蹄疫O型合成肽苗和猪瘟疫苗,21天后口蹄疫O型抗体效价可达70%以上。     

母猪妊娠期免疫猪瘟疫苗的临床观察

<正>2010年2月和2011年10月,笔者在临床遇到2例因母猪在妊娠期免疫猪瘟疫苗造成所产仔猪发生猪瘟的病例,报道如下。1病例1农六师101团耿某猪场分别在2010年2月20日—3月9日有3头母猪产仔,3窝产活仔猪数分别为9头、11头、12头,均无死胎。3窝仔猪均表现出生