体细胞核移植技术生产猪植酸酶转基因胚胎的研究

为获得具有植酸酶腮腺特异性表达的猪转基因克隆胚胎,本研究使用植酸酶腮腺特异性表达的DNA质粒(包含腮腺分泌蛋白(parotid secretary protein,PSP)启动子与终止子序列、Neo筛选基因、绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和高比活的植酸酶appA基因),采用脂质体转染和基因素418(G418)药物抗性筛选的方法获取稳转细胞系,并利用体细胞核移植技术获得植酸酶转基因胚胎。结果表明,本研究构建的DNA质粒可用于细胞筛选,且质粒越小,细胞的转染效率越高,14.89 kb的YM6552仅获得了7.1%的转染率,EGFP质粒则获得了43.4%的转染效率。在单克隆形成上,较小的pYN3600也获得了更高的单克隆形成数(25个),其中表达EGFP的单克隆有14个,植酸酶PCR阳性集落有11个,高于YM6552的单克隆数(19、8和6)。转基因细胞构建重构胚胎后,所有的胚胎均能表达绿色荧光蛋白,虽其体外发育能力有所下降,但差异不显著(P>0.05)。综上所述,本研究所采用的植酸酶质粒、细胞筛选方法和核移植技术可生产植酸酶重构胚。     

转基因家蚕生物反应器研究进展

综述了近年来国内外转基因家蚕生物反应器研究进展,分析探讨了现阶段利用转基因家蚕生物反应器表达外源基因研究中存在的问题及发展方向。     

CRISPR/Cas9 knock-in介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究进展

利用动物生物反应器生产重组蛋白是一种具有应用前景的生物技术。鸡输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免蛋白提取过程中对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。目前利用慢病毒结合原始生殖细胞(PGCs)制备转基因鸡被认为是最可行的方法,但因外源基因随机整合且生殖系传递效率较低,使转基因鸡研究受到技术上的限制。而2013年问世的CRISPR/Cas9基因敲入(CRISPR/Cas9 knock-in)技术能够使外源基因精准定向插入基因组特异性位点,这对生产输卵管特异性转基因鸡具有重大意义。文章综述了鸡输卵管反应器的研究进展、CRISPR/Cas9 knock-in技术在输卵管特异性表达转基因鸡研究和鸡育种领域的应用现状,并指出了目前存在的问题和相应的解决办法。     

利用动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ

转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶中获 取重组蛋白。利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景。本文就转基因动物 乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ的载体构建、研究现状以及存在的问题等作一综述。     

利用动物乳腺生物反应器生产人凝血因子IX

转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达,并从转基因动物奶中获取重组蛋白.利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景.本文就转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ的载体构建、研究现状以及存在的问题等作一综述.     

利用动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ

转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并从转基因动物奶中获取重组蛋白。利用转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ是一种新型的生物制药方法且具有广阔的应用前景。本文就转基因动物乳腺生物反应器生产人凝血因子Ⅸ的载体构建、研究现状以及存在的问题等作一综述。     

转基因家畜生物反应器浅谈（续）

转基因家畜生物反应器浅谈（续）陈庄，魏平华（广东省农科院畜牧研究所广州５１０６４０）２转基因家畜生物反应器研究的进展目前，转基因动物研究有三大焦点：一是转基因方法研究；二是利用转基因动物来研究动物基因的表达调控机制；三是利用转基因动物生产非常规畜牧产...     

动物生物反应器研究进展

动物生物反应器是指将外源目的基因导入整合到动物基因组中，该外源基因可以遗传给后代，并能够表达相应目标蛋白，所获得的个体表达系统就是动物生物反应器。这样的一个具有动物生物反应器功能的转基因动物，其体内可以合成所需的蛋白，并通过乳汁、尿液、血液、精液、蛋清或蚕丝等分泌产生。     

动物乳腺生物反应器在现代生物制药中的应用

目的基因在乳腺中表达的转基因动物称为动物乳腺生物反应器(mammary gland bioreaetor),又称为动物个体乳腺表达系统.动物乳腺生物反应器出现于20世纪90年代初,它是一项利用转基因动物的乳房代替生物发酵,大规模生产供人类疾病治疗和保健用的生物活性物质或药用珍稀蛋白的现代生物技术,其核心内容是利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中高效表达,以期通过源源不断地回收乳汁来提取大量有重要药用价值的生物活性外源蛋白.因此,动物乳腺生物反应器在现代生物制药领域中具有广阔的开发前景.     

加快技术整合进程,推进生物工程产业化升级

自从1980年第一只转基因鼠在耶鲁大学FrankRuddle教授的实验室中诞生以来(Gordon等,1980),转基因动物在医药开发、异种器官移植等方面就获得了前所未有的重视。当克隆羊Dolly在1997年出生,动物克隆对转基因研究领域所带来的冲击又引起了公共媒体和科研工作者的关注。动物乳腺生物反应器(mammaryglandbioreactor),或称动物个体乳腺表达系统,是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体,制作转基因动物,指导特定外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达,以期从分泌乳汁中获得外源活性蛋白。它是一个专门化的分泌腺体,是转基…     

Cloning of pig parotid secretory protein gene upstream promoter and the establishment of a transgenic mouse model expressing bacterial phytase for agricultural phosphorus pollution control

This study examined the feasibility of using the promoter of the pig parotid secretory protein (PSP) gene for expression of the phytase transgene in mouse models. The pig parotid secretory protein gene is specifically expressed at high levels in the salivary glands. The 10-kb upstream promoter region of the gene necessary for tissue-specific expression has been identified. We have constructed phytase transgenes composed of the appA phytase gene from Escherichia coli driven by the upstream promoter region of the pig PSP gene with a 3' tail of either bovine growth hormone or the pig PSP gene polyadenylation signal. Transgenic mouse models with the construct showed that the upstream region of the pig PSP gene is sufficient for directing the expression of phytase transgenes in the saliva. Expression of salivary phytase reduced fecal phytate by 8.5 and 12.5% in 2 transgenic mouse lines, respectively. These results suggest that the expression of phytase in salivary glands of monogastric animals offers a promising biological approach to relieve the requirement for dietary phosphate supplements and to reduce phosphorus pollution from animal agriculture.     

5个繁殖候选基因在香猪卵巢和子宫中的差异表达

本实验旨在明确香猪卵巢转录组测序筛选出的5个候选基因是否对卵巢和子宫有直接的调节作用。采用荧光定量PCR方法,检测发情与未发情期香猪卵巢和子宫中SLPI、INHA、SERPINE1、MSMB和PTGFR基因的组织差异表达。结果表明:SERPINE1基因在不同时期和不同组织中的表达变化不明显;与未发情期相比,INHA基因在发情期香猪卵巢中的表达水平极显著升高(P0.01),SLPI基因在发情期香猪卵巢和子宫中的表达水平分别显著(P0.05)和极显著上升(P0.01),MSMB基因在发情时期卵巢和子宫中的表达量显著降低(P0.05),INHA、PTGFR基因在发情期子宫中的表达量明显减少(P0.05)。结果提示,INHA、SLPI、MSMB基因对香猪卵巢和子宫都有调节作用,而PTGFR仅对子宫有调控作用。     

Pax7基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律研究

本试验旨在探究Pax7(paired box 7)基因在猪不同组织中的表达特征及其在背最长肌中的发育性表达规律.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blotting技术检测了Pax7基因在1日龄马身猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、下丘脑、小脑、背最长肌、腰大肌、股二头肌12种组织中的mRNA和蛋白质表达谱,以及马身猪和大白猪从出生1日龄到180日龄7个发育阶段(1、30、60、90、120、150、180日龄)背最长肌中的发育性表达规律.结果表明,Pax7基因mRNA在背最长肌、腰大肌、股二头肌、下丘脑和小脑组织中表达,而Pax7蛋白仅在背最长肌、腰大肌和股二头肌中表达.背最长肌中Pax7基因mRNA和蛋白质的发育性表达趋势在马身猪和大白猪中基本一致.在mRNA水平上,30日龄的表达量最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);1日龄的表达量次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.Pax7蛋白表达量在1日龄时最高,极显著高于其他日龄(P <0.01);30日龄次之;其他日龄维持低表达的稳定状态.从出生1日龄到180日龄,马身猪背最长肌中Pax7蛋白的表达量均显著或极显著地高于大白猪(P <0.05;P <0.01).Pax7 基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关.     

Study on the Expression Profile of Pax7 Gene and its Developmental Expression in Longissimus Dorsi of Pigs

The aim of this study was to investigate the expression profile of Pax7 (paired box 7) gene in different tissues and its developmental expression in longissimus dorsi of pigs.The expression profiles of Pax7 gene at the levels of mRNA and protein in 12 different tissues including heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,small intestine,hypothalamus,cerebellum,longissimus dorsi,biceeps femoris,psoas major of Mashen pigs at birth and the developmental expression patterns in longissimus dorsi at seven stages (1,30,60,90,120,150,and 180-day old) of Mashen and Large White pigs were studied by quantitative Real-time PCR and Western blotting.The results showed that the Pax7 mRNA was expressed in longissimus dorsi,biceeps femoris,psoas major,hypothalamus,and cerebellum,wherease the Pax7 protein was only expressed in skeletal muscles of longissimus dorsi,biceeps femoris,and psoas major.The developmental expression patterns of Pax7 mRNA and protein in Mashen pig was basically in accordance with those in Large White pig.The mRNA expression amount of Pax7 gene in longissimus dorsi was the greatest at 30-day old (P <0.01),followed by the expression at 1-day old,and kept lower stable levels at other stages both in Mashen and Large White pigs.At the stages of 30-day,90-day,and 180-day old,Pax7 mRNA expression amounts in Mashen pig were significantly higher than those in Large White pig (P <0.01).The Pax7 protein expression at 1-day old was the greatest (P <0.01),followed by it at 30-day old,which were significantly greater than those at other stages,at which Pax7 expression was in lower stable levels.The Pax7 protein expression from one-day old to 180-day old in Mashen pig was significantly greater than those in Large White pig (P <0.05;P <0.01).The expression of Pax7 gene could associated with tissue,age,and background of pig breed.     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素（interferon-beta，IFN-β）基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象，提取肝脏总RNA并反转录为cDNA，设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区，将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上，获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β，并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析；将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明，从江香猪IFN-β基因编码区长为561 bp，编码186个氨基酸；该蛋白为分泌性蛋白，前21个氨基酸为信号肽序列；二级结构主要以α-螺旋（77.42%）和无规则卷曲（17.74%）为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%~100.0%，与禽的同源性最低（35.2%）；从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%，但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%，存在E43Q、K73R和C161R 3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示，带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别，条带大小约为24 ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

CREB-H基因在猪不同组织中表达谱及肝脏中的表达规律

本研究旨在分析环腺苷酸应答元件结合蛋白H（cyclic AMP-responsive element-binding protein 3-like 3，CREB-H）在猪不同组织中的表达谱及其在马身猪和大白猪肝脏中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测1日龄猪12个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、小脑、下丘脑、背最长肌、股肌和腰肌）中CREB-H基因的表达谱，以及CREB-H在1、30、60、90、120、150和180日龄马身猪和大白猪肝脏中的表达规律。结果显示，CREB-H基因mRNA在马身猪的12个组织中广泛表达，其中在肝脏和小肠中高表达；CREB-H蛋白在肝脏组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在心脏、脾脏和小脑中不表达。猪肝脏CREB-H基因mRNA和蛋白的发育表达受日龄、品种、品种与日龄相互作用的影响（P<0.01）。马身猪和大白猪肝脏中CREB-H基因mRNA和蛋白的表达量均在1日龄时达到最大值。在各发育阶段，马身猪CREB-H蛋白的表达量均极显著高于大白猪（P<0.01），且CREB-H主要在猪肝脏中表达。CREB-H在两猪种肝脏中的表达存在时空差异，可能与猪在不同发育期的脂质代谢能力有关，本试验结果为研究猪的脂质代谢调控机制提供一定的理论依据。     

Trophinin is expressed in the porcine endometrium during the estrous cycle

We investigated endometrial expression of trophinin mRNA and protein, homophilic cell adhesion molecules, during the estrous cycle of gilts. An immunopositive reaction for trophinin was observed in the luminal and glandular epithelia of the endometrium at all stages of the estrous cycle, but not in endometrial stromal cells or the myometrium. A partial coding sequence of porcine trophinin was similar to sequences in humans and mice, with homologies of 75% and 70%, respectively. As in humans and mice, the trophinin gene is expressed in the endometrium. Trophinin, however, is expressed in the endometrium of the pig throughout the estrous cycle, higher expression levels were observed at some points of the luteal phase, as in humans. These findings suggest that regulation of trophinin gene expression in the pig is different from that in mice, but similar to that in humans. Furthermore, the present results suggest that the pig might be a suitable model for studying the physiological importance of trophinin in early pregnancy in humans.     

Phenolsulfonphthalein test in healthy sheep and in sheep with reductions in functional renal mass

The phenolsulfonphthalein (PSP) plasma clearance and urinary excretion tests were applied to sheep before and after 50% and 75% reductions in functional renal mass. The PSP determinants found most useful as indicators of renal mass reduction were the 15-minute urinary excretion percentage and the 60-minute (PSP60) plasma concentration. Although both of these determinants could be used to detect renal mass reduction, the 15-minute PSP excretion percentage was the more sensitive. The PSP60 value was influenced by factors other than reduced nephron numbers; the contraction of the PSP volume of distribution that occurred after renal mass reduction was one important influencing factor. Overall, the PSP tests more accurately reflected the volume of blood delivered to the kidney than the proximal tubular secretory capacity.     

鸡输卵管生物反应器的研究进展

目前鸡输卵管生物反应器的研究集中在以卵清蛋白调控区来调控外源基因的表达。鸡输卵管生物反应器的研究以输卵管细胞的培养为起点 ,再研究外源基因在输卵管内定位表达的可能性 ,最后制作转外源基因能稳定遗传的转基因鸡。本文对鸡输卵管生物反应器研究作一综述 ,提出了存在的问题并作以展望。     

猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)在不同发育期的mRNA表达研究

猪蛔虫病严重危害我国养猪业的发展,通过研究在感染期的表达基因来研究其发育繁殖机制,以达到预防和控制该病的目的已成为猪蛔虫研究的发展趋势。本研究以β-actin为内参,采用半定量RT-PCR方法鉴定分析猪蛔虫微管蛋白α-链基因(13E09)丰度随不同阶段虫体在虫体不同发育阶段的mRNA表达水平的变化,结果显示,该在感染期幼虫呈高丰度表达外,肠四期即(L4)幼虫也有多量表达,在雄虫、虫卵期也有少量表达,但在雌虫和肺三期幼虫均未检测出该基因的表达,该基因是在感染期幼虫呈高丰度表达的基因,可能在感染宿主过程中起重要作用。这为进一步研究该基因的功能提供了科学依据。