基于转录组测序分析象草木质素合成的研究

采用高通量测序技术Illumlna HiSeq 2000对高木质素的象草品系eg7和低木质素的象草品系eg87(对照)茎组织进行转录组比较测序。测序获得了169630902个序列读取片段(reads),包含13788439920nt碱基信息。对reads进行序列组装,获得87641个单基因簇(unigene),平均长度580nt。从长度分布、GC含量等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。将获得的unigene与Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库进行序列同源性比较和功能分析,62557个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性,象草与高粱序列同源性最高。共鉴定出33323个差异表达基因,其中上调基因9704个(29.12%),下调基因23619个(70.88%);GO分析显示39968个unigene归为54个功能类别,大量unigene与细胞进程、代谢过程、催化活性等相关;KEGG pathway分析富集得到127条代谢通路,包括光合作用、betalain生物合成、苯丙烷类代谢、苯丙氨酸代谢等,苯丙烷类代谢途径差异基因富集程度高、差异基因数目最多,达285条,该途径中64条木质素单体合成酶基因表达上调,79条ClassⅢ型植物过氧化物酶基因表达下调、22条上调。挑选9个差异基因进行qRT-PCR验证,9个基因的表达趋势与高通量测序结果一致。为象草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据,对于了解象草茎生物合成与木质素调控基因挖掘和多用途定向育种具有指导意义。     

基于转录组测序分析象草木质素合成的研究

采用高通量测序技术Illumlna HiSeq 2000对高木质素的象草品系eg7和低木质素的象草品系eg87(对照)茎组织进行转录组比较测序。测序获得了169630902个序列读取片段(reads),包含13788439920nt碱基信息。对reads进行序列组装,获得87641个单基因簇(unigene),平均长度580nt。从长度分布、GC含量等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。将获得的unigene与Nr、Nt、Swiss-Prot、COG、GO和KEGG数据库进行序列同源性比较和功能分析,62557个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性,象草与高粱序列同源性最高。共鉴定出33323个差异表达基因,其中上调基因9704个(29.12%),下调基因23619个(70.88%);GO分析显示39968个unigene归为54个功能类别,大量unigene与细胞进程、代谢过程、催化活性等相关;KEGG pathway分析富集得到127条代谢通路,包括光合作用、betalain生物合成、苯丙烷类代谢、苯丙氨酸代谢等,苯丙烷类代谢途径差异基因富集程度高、差异基因数目最多,达285条,该途径中64条木质素单体合成酶基因表达上调,79条ClassⅢ型植物过氧化物酶基因表达下调、22条上调。挑选9个差异基因进行qRT-PCR验证,9个基因的表达趋势与高通量测序结果一致。为象草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据,对于了解象草茎生物合成与木质素调控基因挖掘和多用途定向育种具有指导意义。     

海滨雀稗自交结实突变体及野生型幼穗组织的转录组分析

二倍体海滨雀稗Adalayd作为自交不亲和的暖季型草坪草,在环境保护及修复上发挥着重要的作用,但由于自身自交不亲和性减缓了其大面积推广。至今海滨雀稗自交不亲和的机制尚且未知并且基因数据库资源十分匮乏。为了研究海滨雀稗自交不亲和的机制,以二倍体海滨雀稗自交亲和体细胞突变体SP2008-3和自交不亲和野生型Adalayd为材料,采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术进行转录组测序。获得2个材料幼穗组织的表达谱,共获得68175654个Raw reads片段,测序结果de novo拼接获得117619个单基因簇(Unigene),其中50%的Unigene被注释。比较两个基因表达谱,发现1303个差异表达基因并对这些差异基因进行了基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分类,筛选出了22个与植物自交不亲和反应相关的基因,其中14个钙离子信号通路(钙调素、钙依赖蛋白激酶、类钙调素互作蛋白激酶)、3个F-box和5个硫氧还蛋白(thioredoxin)基因在体细胞突变体SP2008-3和野生型Adalayd之间存在差异表达,测序结果获得了很多与海滨雀稗自交不亲和相关的遗传资源信息。本研究首次将转录组学研究应用于海滨雀稗自交不亲和研究,为海滨雀稗自交不亲和进一步研究提供了宝贵且有价值的基因信息基础。     

海滨雀稗自交结实突变体及野生型幼穗组织的转录组分析

二倍体海滨雀稗Adalayd作为自交不亲和的暖季型草坪草,在环境保护及修复上发挥着重要的作用,但由于自身自交不亲和性减缓了其大面积推广。至今海滨雀稗自交不亲和的机制尚且未知并且基因数据库资源十分匮乏。为了研究海滨雀稗自交不亲和的机制,以二倍体海滨雀稗自交亲和体细胞突变体SP2008-3和自交不亲和野生型Adalayd为材料,采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术进行转录组测序。获得2个材料幼穗组织的表达谱,共获得68175654个Raw reads片段,测序结果de novo拼接获得117619个单基因簇(Unigene),其中50%的Unigene被注释。比较两个基因表达谱,发现1303个差异表达基因并对这些差异基因进行了基因本体论(gene ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分类,筛选出了22个与植物自交不亲和反应相关的基因,其中14个钙离子信号通路(钙调素、钙依赖蛋白激酶、类钙调素互作蛋白激酶)、3个F-box和5个硫氧还蛋白(thioredoxin)基因在体细胞突变体SP2008-3和野生型Adalayd之间存在差异表达,测序结果获得了很多与海滨雀稗自交不亲和相关的遗传资源信息。本研究首次将转录组学研究应用于海滨雀稗自交不亲和研究,为海滨雀稗自交不亲和进一步研究提供了宝贵且有价值的基因信息基础。     

基于桑树转录组测序的SSR标记开发和引物筛选

以桑树品种抗青10号植株的幼叶和根部为材料进行高通量转录组测序,获得60 069条unigene序列,运用MISA软件从中搜索到10 268个SSR位点,并针对这些SSR位点建立了EST-SSR引物数据库。从EST-SSR引物数据库中随机挑选100对SSR引物对抗青10号植株叶片的基因组DNA进行PCR验证,有87对引物可以扩增出条带,其中58对引物扩增的片段大小与预期相同,26对引物扩增的片段大于预期片段,3对引物扩增的片段小于预期片段。100对引物涉及的SSR位点中,基序重复单元长度为3个核苷酸的占46%,为2个、4个、5个、6个核苷酸的分别占12%、10%、10%、22%。KEGG代谢通路分析100对引物所在unigene的功能主要涉及新陈代谢、甘油磷脂代谢、醚脂代谢等途径,扩增条带最多的引物SSR28所在的Unigene5642主要参与新陈代谢。实验结果证明了基于高通量桑树转录组测序数据开发SSR标记的可行性及高效性。     

沙鞭全长转录组测序及生物信息学分析

为了明晰沙鞭(Psammochloa villosa)的转录组特征，本研究利用PacBio Sequel测序平台首次对其进行全长转录组测序和数据分析，结果共获得323 309个clean reads,自我矫正产生环形一致性序列(CCS)673 540个，预测得到蛋白编码区(CDS)序列28 447个；MISA软件共搜索得到沙鞭93 563个简单重复序列(SSR),分布于56 824条unigene上；转录本基因功能注释，共有166 541条序列得到NR注释，结果显示沙鞭与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)亲缘最近；KOG数据库比对将97 892个unigene分为25个功能类别，其中注释较多的功能为翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣；GO数据库比对共注释到87 930个unigene,分为生物过程、细胞组成和分子功能3大类及62个亚类分支；KEGG结果表明碳水化合物代谢、信号转导、能量代谢通路中注释基因较多。本研究结果丰富了沙鞭的遗传信息，为今后沙鞭关键耐旱基因的挖掘提供了理论依据。     

海滨雀稗液泡膜H＋-PPase（PvVP1）5′端的克隆和序列分析

根据已公布液泡膜 H＋-PPase基因家族同源序列保守区设计简并引物，克隆出海滨雀稗中PvVP1基因的中间序列，然后用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA end，RACE）方法，从海滨雀稗中克隆到PvVP15′cDNA序列。该序列ORF长1605 bp，编码535个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与玉米相应基因的同源性分别为93％和99％。     

紫花苜蓿耐苏打盐碱相关基因的转录组学分析

为了揭示紫花苜蓿适应苏打盐碱环境胁迫机制,本试验采用Illumina HiSeq 4000测序技术对紫花苜蓿叶片进行转录组测序并对基因进行功能预测,测序共获得91 853个Unigenes,总碱基数为65 369 474 bp。Unigenes序列长度分布显示,测序质量较好,可信度高,其中,45 540个Unigenes与其它生物的基因有不同程度的同源性,通过GO,COG及KEGG数据库注释,将Unigenes具体定位到次生代谢物的生物合成途径、抗生素合成途径、光合作用途径等。紫花苜蓿叶片苏打盐碱胁迫响应中GH3,MYB,HSF等转录因子均发生不同程度的上调,而EREBP转录因子总体受到抑制,同时候选了4CL,PP2C基因及相关转录因子。从91 853个Unigenes中共检测到10 949个SSR位点,包括6类核苷酸基序,A/T出现频率最高,其次为AG/CT和AAG/CTT。qRT-PCR荧光定量检测5个基因的表达趋势与RNA-Seq分析结果一致,证明RNA-Seq测序的可靠性。本研究通过对紫花苜蓿转录组研究,为优质牧草的分子生物学研究提供数据库来源。     

牦牛皱胃全长转录组测序分析

【目的】 获得牦牛(Bos grunniens)皱胃全长转录组数据库,深入挖掘牦牛皱胃功能基因。【方法】 采用PacBio Sequel高通量测序系统,使用单分子实时(single molecular real time,SMRT)测序技术对成年牦牛皱胃全长转录组进行测序,对原始数据进行质控和去冗余分析,再比对参考基因组获取过滤后的非重复序列(Unigenes),使用多种生物信息软件对牦牛皱胃全长转录本数据进行功能注释、转录因子注释、编码区预测、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)分析及可变剪接分析。【结果】 通过测序共获得14467420条子序列,平均子序列长度为3 344.23 bp,质控得到循环一致性序列(CCS)有296840条,全长非嵌合(FLNC)序列有277 402条,过滤和去冗余后对比参考基因组最终获得8 556条Unigenes。通过与NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO和Pfam数据库比对,对Unigenes进行注释,其中NR数据库注释了8 544条Unigenes;Swiss-Prot数据库注释了8 475条Unigenes;KEGG数据库注释了1721条Unigenes;KOG数据库注释了6 572条Unigenes;eggNOG数据库注释了8491条Unigenes;GO数据库注释了7 725条Unigenes;Pfam数据库注释了8 162条Unigenes。此外,经鉴定或预测,还获得了943个转录因子、8544个编码区片段、3596个SSR位点和1 825个可变剪接事件。【结论】 本研究获得了较为可靠的牦牛皱胃全长转录组数据,可为进一步研究牦牛皱胃生物学特性、相关代谢途径、信号通路及其分子机制提供数据支持。     

黔金荞麦1号转录组测序及生物信息学分析

为了探究黔金荞麦1号种质资源遗传背景、挖掘基因表达和群体遗传学信息,试验采用Illumina HiSeq~(TM)2500高通量测序技术平台对黔金荞麦1号进行转录组测序,并结合生物信息学对转录组数据进行分析。结果表明:测序质控共得到39 954 078条校正数据(clean reads),包含了5.7 Gb碱基序列信息。对clean reads组装聚类去冗余,获得40 919个单基因簇(Unigene),预测出36 741个编码区序列(Coding sequence,CDS)。将Unigene与9大数据库进行比对注释、基因功能及代谢通路分析,共有33 486(81.83%)条Unigene得到注释;13 856条Unigene注释到KOG数据库的25个分类中,其中参与翻译修饰、一般功能及信号传导方面相关注释基因最多;KEGG通路分析共有2 854条Unigene注释到23条代谢通路,其中参与代谢通路、信号传导的注释基因最多。基因结构分析共检测到16 152个单核苷酸突变(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点、1 243个插入缺失标记(insertion-deletion,InDels)及1 419条Unigene含有短片段重复序列(Simple sequence repeat,SSR)位点,其中SSR以三核苷酸重复基元类型最多(983个),占69.27%,以GCC/GGC为主要优势重复序列。说明黔金荞麦1号具有较强的代谢活动和遗传信息处理及修饰能力,并存在丰富的基因结构多样性,可为后期进一步研究其代谢途径、分子遗传标记和基因工程提供基础数据。     

不同品种紫花苜蓿转录组分析及营养品质差异的探讨

为了丰富紫花苜蓿转录组数据信息,找出不同品种紫花苜蓿的差异基因及代谢通路。通过Illumina HiSeq 4000平台对准格尔和WL319HQ的苜蓿叶片的RNA文库进行de novo组装。得到了约39G总的核苷酸,2亿多个reads,组装得到66734个Unigenes,平均长度为869 bp。将所得到的Unigenes与NCBI nonredundant protein(Nr),A manually annotated and reviewed protein sequence database(Swissprot),Clusters of eukaryotic orthologous groups(KOG)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)数据库比对,分别获得44888(67.26%),29190(43.74%),24844(37.23%)和15647(23.45%)条序列的注释信息。在2个紫花苜蓿叶片中找到1098个差异表达基因 (DEGs) ,其中有706个上调,392个下调(准格尔-vs-WL319HQ)。对其差异基因做了Gene ontology(GO)功能分析和KEGG途径分析,初步分析了2个品种营养品质差异的内在原因。极大地丰富了紫花苜蓿转录组数据信息,为今后紫花苜蓿的转录组测序提供理论依据,同时为紫花苜蓿生产实践提供参考。     

猪源大肠杆菌O157∶H7毒力差异株的转录组测序分析

为了解大肠杆菌O157∶H7毒力差异株转录组差异,丰富O157∶H7转录组数据信息,本研究采用Illumina HiSeq^TM 2000平台对两株大肠杆菌O157∶H7毒力差异株进行高通量测序,测序数据采用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。结果发现,经过测序,两个菌株分别获得3 113 118和2 944 912条reads,比对到参考基因组上的reads分别占总reads的83.76%和78.97%。以中等毒力株为参考,在高毒力株中共获得941个差异表达基因,其中上调基因637个,下调基因304个。GO功能注释分析表明,差异表达基因主要与催化活性功能、黏附、转运活性、受体活性、酶调节活性、定位、生化调节、运动等诸多生理生化过程相关;KEGG富集分析发现共有425个基因注释到160个代谢通路中,其中新陈代谢、核糖体、鞭毛合成、嘧啶代谢、糖类代谢、细菌趋化等通路显著富集。此次通过大肠杆菌O157∶H7毒力差异株转录组研究对差异表达基因涉及的信号调控及可能的功能基因进行了探索,丰富了转录组信息,为进一步开展大肠杆菌O157∶H7毒力相关基因的研究及分子调控机制奠定了基础。     

基于高通量测序的水貂胚胎滞育期和激活期卵巢转录组分析

试验旨在获取胚胎滞育期与激活期水貂卵巢组织的转录组信息，挖掘滞育的胚胎激活前后水貂卵巢差异表达基因（DEGs）及其功能信息，为探讨卵巢信号调控水貂胚胎滞育的分子机制提供参考。随机采集8只健康雌性水貂（胚胎滞育期和激活期各4只）的卵巢组织为样本，利用Illumina HiSeq平台RNA-Seq技术对其进行转录组测序，筛选在水貂胚胎滞育期和激活期卵巢中的DEGs并进行生物信息学分析。结果显示，测序获得661 195 568个raw reads，经过滤后获得650 834 900个clean reads，组装后得到389 895个unigenes，通过与Nr、GO、KOG和KEGG数据库比对，对unigenes进行注释，其中Nr数据库注释了156 419个unigenes；GO数据库注释了122 657个unigenes；KOG数据库注释了58 320个unigenes；KEGG数据库注释了72 653个unigenes。滞育期和激活期卵巢中有1 797个DEGs，与胚胎滞育期水貂卵巢相比，激活期卵巢有1 298个DEGs显著上调，499个DEGs显著下调。GO功能分析发现，DEGs显著富集的生物学过程主要有跨膜信号受体活性、信号受体活性、G蛋白偶联受体活性、酶联受体蛋白信号通路、细胞表面受体信号通路、细胞周期阻滞、芳香酯酶活性。KEGG通路分析发现，水貂滞育期和激活期卵巢中的DEGs显著富集于神经活动配体-受体相互作用信号通路。本研究利用高通量测序技术获得水貂胚胎滞育期与胚胎激活期卵巢的转录组信息，为深入探究水貂卵巢调节胚胎滞育的分子机制奠定了基础。