水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响,以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27 h或30 h的囊胚发育率(19.0%、17.7%)明显高于体外成熟21 h或24h的囊胚发育率(12.3%、13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚.     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MII期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,且卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一。本试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较。结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率（19.0%or 17.7%）明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率（12.3%or 13.8%）;Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚（13.0%vs.21.7%）。     

水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较

对MⅡ期水牛卵母细胞进行人工诱导激活可以帮助人们间接判断体外成熟卵母细胞质量的优劣,并且,卵母细胞的充分激活也是提高核移植效率的关键因素之一.试验比较了水牛卵母细胞体外成熟时间对孤雌激活胚发育能力的影响以及不同化学激活方法对水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响,并在相同条件下,对孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力进行了比较.结果表明,水牛卵母细胞体外成熟27h或30h的囊胚发育率(19.0%or 17.7%)明显高于体外成熟21h或24h的囊胚发育率(12.3%or 13.8%);Ion联合6-DMAP激活水牛卵母细胞的效果优于其他几组激活方法;在相同条件下,孤雌激活胚与体外受精胚的发育能力存在着差异,其中卵裂率差异不显著,但孤雌激活胚的囊胚发育率显著高于体外受精胚(13.0%vs.21.7%).     

Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响

本研究的目的是探讨Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响.体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精或离子霉素孤雌激活后.分别在舍0,0.5,5,50和500 μg/L Ghrelin的培养液中进行体外培养,观察各组胚胎的卵裂率和囊胚率.结果显示,在培养液中添加不同浓度的Ghrelin对体外受精和孤雌激活胚胎的卵裂率均无显著影响(P>0.05),但添加500 μg/L的Ghrelin显著提高体外受精胚胎的囊胚发育率(33.5% vs 13.7%,P<0.05),50 μg/L或500 μg/L的Ghrelin均显著提高孤雌激活胚胎的囊胚发育率(32.4%和34.6% vs 14.5%,P<0.05).结果表明,培养液中添加Ghrelin对胚胎的早期卵裂没有影响,但可促进水牛体外受精和孤雌激活胚胎囊胚的形成.     

细胞骨架抑制剂、电激活液对兔卵孤雌激活和发育的影响

应用细胞骨架抑制剂细胞松弛素B和秋水仙素处理兔成熟卵母细胞，然后采用电激活的方法激活兔卵母细胞，观察细胞骨架抑制剂对兔卵母细胞孤雌激活和孤雌发育的影响，结果表明：应用不同的电激活液，即甘露醇、Zimmerman氏和山梨醇对兔卵母细胞的孤雌激活效果无显著性差异（P〉0．05）；用7．5μg&#183;mL^-1细胞松弛素B处理卵母细胞后孤雌激活，其2-细胞胚率（82．2％）和囊胚发育率（43．4％）与对照组（76．4％和51．5％）相比无显著性差异（P〉0．05）；用1μg&#183;mL^-1秋水仙素处理兔卵母细胞，兔卵母细胞孤雌激活后的2-细胞胚率（64．9％）和囊胚发育率（23．8％）明显下降，与对照组相比存在显著性差异（P〈0．05）；用细胞松弛素B和秋水仙素共同处理的2-细胞胚率（62．5％）和囊胚发育率（30．9％）与秋水仙素单独处理的结果无显著性差异（P〉0．05）。因此，秋水仙素对兔卵母细胞的孤雌激活影响比CB更大。通过免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜观察发现，细胞骨架抑制剂处理后，经孤雌激活获得的囊胚中，微丝和微管结构未见异常。     

卵泡数量对陕北白绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索陕北白绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,试验以屠宰场陕北绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵泡数量对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。根据卵泡数目的差异分为3组,其中卵泡数目大于15个的设为Ⅰ组,卵泡数目在8~14个之间的和卵泡数目在1~7个之间的分别设为Ⅱ组和Ⅲ组。对山羊卵母细胞及孤雌激活后胚胎进行体外培养后,进而根据山羊卵母细胞体外成熟率、孤雌激活胚卵裂率和囊胚发育率来分析卵泡数量对其发育的影响。结果显示卵泡数目在8~14个之间的Ⅱ组山羊卵母细胞体外成熟率显著高于其他两组(P0.05),而这3组间的卵裂率和囊胚率差异不显著(P0.05)。表明山羊卵泡数目的过多或过少降低了卵母细胞体外成熟效率,且对孤雌激活胚的发育能力无影响。     

不同成熟时间的猪卵母细胞对体外受精的影响及孤雌发育

采用NCSU-37为体外成熟、受精、培养体系,比较不同成熟时间46h、58h和70h的猪卵母细胞对体外受精的影响和孤雌发育。结果显示,猪卵母细胞在体外成熟培养46h、58h和70h后,46h培养组的卵母细胞体外受精后的卵裂率明显低于58h和70h培养组(P<0.05),但囊胚发育率明显高于其他两组(P<0.05)。46h组的孤雌发育率明显高于其他两组(P<0.05),囊胚发育率三组之间无显著差异。表明猪卵母细胞体外成熟培养时间延长,体外受精后的囊胚发育率降低,孤雌发育率相应增加。     

人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率（72.35％）显著高于对照组的极体排出率（52.86％）（P＜0.01）;经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82％,对照组为4.76％,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。     

体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响

本试验在卵母细胞体外成熟的研究基础上,研究了培养用水、卵泡液和成熟时间对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后发育潜力的影响.结果表明(1)将卵母细胞分别于蒸馏水和Milli-Q超纯水配制的成熟培养液中培养22～24 h, 孤雌激活后, 卵裂率无显著差异(P>0.05); 但孤雌卵在超纯水配制的胚胎培养液中培养,囊胚发育率为22.3%, 明显高于在蒸馏水配制的培养液中的囊胚发育率14.1%(P<0.05).(2)在成熟培养液中添加10%、20%卵泡液,成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(32.3%, 30.9%)明显高于添加5%和0%卵泡液组的囊胚发育率(21.8%, 22.7%,P<0.05).卵母细胞在添加20%卵泡液的培养液中成熟培养,孤雌激活后囊胚孵化率明显低于添加0、5%、10%卵泡液组的囊胚孵化率(P<0.05).(3)成熟28 h或30 h的卵母细胞孤雌激活后,其囊胚发育率(30.5%或29.4%)明显高于成熟24 h或26 h组的囊胚发育率(20.5%或22.1%,P<0.05).     

曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响

曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现：（1）5nmol／LTSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率（P〈0．05）;（2）50nmol／LTSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05）;（3）50nmol／LTSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05,82．1％&#177;2．6％和37．4％&#177;3．1％）。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol／L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol／LTSA处理24h能提高孤雌胚胎的发育能力。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的初步探讨

主要探讨无卵丘水牛卵母细胞体外成熟的可行性,以便为研究卵母细胞成熟机理提供模型。无卵丘的水牛卵母细胞随机分为5组,然后分别进行直接成熟培养（M1）,与卵丘细胞单层共培养（M2）,用未扩展的卵丘细胞块包围培养（M3）,与扩展的卵丘细胞团共培养（M4）和用卵巢组织包围培养（M5）。无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟培养24 h后检查第一极体（PB1）排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活,评定其成熟质量。结果发现,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其它各组间没有显著差异（P〉0.05）;M5组的孤雌激活卵裂率显著低于M1组和M4组（P〈0.05）,而与M2组和M3组没有显著差异（P〉0.05）,但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组（P〈0.05）。这些研究结果表明：（1）未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟,但与卵丘细胞单层共培养没有作用;（2）卵巢组织包围培养不利于水牛卵母细胞的体外成熟。     

马卵母细胞胞质内精子注射后体外发育能力的研究

本研究在非繁殖季节评估卵丘形态(松散型、致密型)、成熟培养体系(TCM 199、NCSU 23)、体外成熟时间(34、38 h)和离子霉素结合6-DMAP激活对马卵母细胞胞质内精子注射(ICSI)后体外发育能力的影响。从屠宰场采集马卵巢,获得的卵母细胞进行体外成熟,然后注射马冷冻解冻精液,统计分裂情况。试验结果表明,①马松散型卵母细胞成熟率显著高于致密型卵母细胞(P<0.05),分别为61.09%和41.24%,但ICSI后36 h分裂率无显著差异(P>0.05),分别为47.34%和44.92%;②两种培养体系对马松散型或致密型卵母细胞成熟率及ICSI后36 h分裂率无显著影响(P>0.05),但相同成熟体系培养松散型卵母细胞成熟率均显著高于致密型卵母细胞(P<0.05),然而ICSI后36 h分裂率差异不显著(P>0.05);③松散型或致密型卵母细胞在TCM 199或NCSU 23中成熟38 h成熟率均高于34 h成熟率,分别为44.43%～68.87%和34.52%～58.90%,松散型卵母细胞在TCM 199体系中成熟34 h、ICSI后激活组或对照组的分裂率显著高于成熟38 h、ICSI后激活组的分裂率(P<0.05),以及致密型卵母细胞在TCM 199体系中成熟34 h、ICSI后激活组的分裂率(P<0.05),而且显著高于松散型卵母细胞在NCSU 23体系中成熟38 h、ICSI后对照组的分裂率(P<0.05);④ICSI后用离子霉素结合6-DMAP激活对马卵母细胞ICSI后36 h分裂无显著影响(P>0.05)。因此,马松散型和致密型卵母细胞的成熟能力存在差异,TCM 199和NCSU 23成熟体系对这2种类型卵母细胞的发育能力无显著影响(P>0.05),马卵母细胞成熟38 h成熟率高于34 h成熟率,TCM 199成熟体系培养松散型卵母细胞34 h进行ICSI后的分裂率最高。离子霉素结合6-DMAP激活对TCM 199或NCSU 23体系成熟马卵母细胞ICSI后的体外发育能力无显著影响(P>0.05)。     

猪体外成熟卵母细胞孤雌激活和胚胎培养的研究

以猪体外成熟卵母细胞为实验材料,研究了不同激活方法、激活时间以及是否添加滋养层细胞的条件对猪成熟卵母细胞体外培养的影响。结果表明,Ionomycin+6-DAMP+CB法卵裂率高,且差异显著;使用6-DMAP激活3h的卵裂率要低于4h和5h组,且差异显著;在卵裂率、8细胞率和囊胚率上,添加滋养层细胞组与未添加滋养层细胞组之间无显著差异,但添加vero细胞后效果略好。     

小鼠卵细胞体外成熟培养及孤雌激活

[目的]利用小鼠卵母细胞体外成熟培养及3种激活方法（乙醇激活、氯化锶激活、乙醇-氯化锶激活）对小鼠卵母细胞进行了孤雌激活研究。[方法]小鼠经注射孕马血清促性腺激素（PMSG）48h后,摘取卵巢获得3级未成熟卵母细胞．在成熟培养液（M199100mL＋丙酮酸钠2．2mg＋抗100IU／mL＋LH2IU／mL＋FCS10％）中对小鼠未成熟卵细胞进行体外成熟培养,获得的成熟卵母细胞分别在乙醇、氯化锶、乙醇一氯化锶不同激活剂中激活,[结果]A级卵母细胞成熟率为79％．B级卵母细胞成熟率为70％,C级卵母细胞成熟率为55％。A级卵母细胞使用氯化锶激活率可达80．0％,为最佳方法。[结论]A级卵母细胞成熟培养效果最好。孤雌激活氯化锶激活效果高于乙醇．．     

Activation of Zona‐Free Buffalo (Bubalus bubalis) Oocytes by Chemical or Electrical stimulation,and Subsequent Parthenogenetic Embryo Development

Parthenogenetic activation using zona‐free oocytes offers an alternative model that could be applied to develop protocols for the activation of reconstructed embryos for cloning. The aim of this study was to compare the efficacy of different methods for the activation of zona‐free buffalo oocytes in terms of their effects on the developmental competence of parthenogenetic embryos. The effects of zona removal on parthenogenetic activation and in vitro developmental competence of metaphase II oocytes were also examined. All activation methods were followed by incubation of 2 mm 6‐dimethylaminopurine (6‐DMAP) for 4 h. Out of three different pulse strengths (1.2, 2.1 or 3.3 kV/cm) used, 2.1 kV/cm resulted in the highest blastocyst rate (25.3%). On comparing different chemical agents and electric pulse, highest blastocyst rate was observed for calcium ionophore (CaI) (28.6%) followed by ethanol (25.0%), electric pulse (22.5%) and combined CaI and ethanol treatment (16.7%) although differences among them were not significant. Furthermore, a significantly reduced developmental potential was observed in zona‐free oocytes when compared to zona‐intact ones up to the blastocyst stage (44.3% vs 27.1%). In conclusion, zona‐free buffalo oocytes can be successfully activated for parthenogenetic development using chemical or electrical stimulation. Out of different agents examined, CaI followed by 6‐DMAP resulted in the highest blastocyst rate.     

水牛和黄牛同种及种间显微授精(ICSI)的初步研究

试验探讨了水牛和黄牛同种及种间显微授精的可行性。体外成熟22~24 h的水牛和黄牛卵母细胞分别注入冷冻/解冻的尼里－拉菲水牛和利木赞黄牛精子,进行同种或种间的显微授精操作,构建的ICSI胚胎一部分培养到16~18 h固定染色检查原核形成情况,另外一部分胚胎培养2~9 d分别记录胚胎的分裂情况及囊胚发育情况。结果发现,水牛同种(水牛+水牛)和水牛异种(水牛+黄牛)显微授精胚胎的双原核率(47.73%和36.67%)、分裂率(68.00%和72.64%)和囊胚发育率(16.44%和22.39%)均无显著差异(P＞0.05);黄牛同种(黄牛+黄牛)和黄牛异种(黄牛+水牛)显微授精胚胎的双原核率(60.00%和45.28%)、分裂率(73.33%和71.31%)和囊胚发育率(28.57%和33.70%)亦无显著差异(P＞0.05)。以上结果表明:①水牛精子注射到黄牛卵子和黄牛精子注射到水牛卵子的种间授精胚胎均可以体外发育到囊胚阶段;②黄牛卵子无论同种和种间显微授精的效果均优于水牛卵子。     

水牛卵母细胞和体外受精早期胚胎端粒酶活性测定

为了解水牛卵母细胞和体外受精（IVF）胚胎早期发育过程中端粒酶的活性变化,本研究利用端粒重复序列扩增法（TRAP）进行了水牛未成熟卵母细胞,成熟卵母细胞和2～4细胞,8～16细胞,桑椹胚以及囊胚各阶段的早期胚胎端粒酶活性的测定。依据电泳条带在成像系统下的光密度值,计算端粒酶的相对活性（RTA）。结果发现,未成熟卵母细胞端粒酶活性比成熟卵母细胞高（P〈0.05）,受精后2～4和8～16细胞胚胎端粒酶活性相对较低,桑椹胚端粒酶活性明显升高（P〈0.05）,囊胚阶段达到最高水平。通过对水牛不同发育阶段胚胎细胞数计数及单细胞相对端粒酶活性的分析比较结果显示,卵母细胞的单细胞端粒酶活性最高,囊胚阶段的最低。单细胞端粒酶活性从未成熟卵母细胞到IVF囊胚阶段呈逐渐降低的趋势。这些结果表明,水牛卵母细胞及早期胚胎的端粒酶活性变化与其成熟、发育阻断及全能性的逐步降低有关。     

水牛体细胞核移植方法比较及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法核移植效果的影响

本研究旨在比较水牛2种体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)方法的效果以及激活前的时间间隔对全细胞胞质内注射法(Whole-Cell Intracytoplasmic Microinjection,WCICSI)核移植效果的影响.采用水牛胎儿成纤维细胞作为供核,比较了透明带下注核法(Perivitelline Microinjection,PM)和WCICSI核移植效果.另外,试验了不同类型的供体细胞进行全细胞胞质内注射后与激活前的受体胞质的最适宜作用时间.结果,WCICSI构建核移植重构胚的成功率显著高于PM(87.1%vs 81.1%,P＜0.05),虽然其重构胚的分裂率极显著低于PM(49.5%vs 71.8%,P＜0.01),但囊胚率、核移植的效率无显著差异(P＞0.05).卵丘细胞和胎儿成纤维细胞在注射后3 h激活,重构胚的囊胚发育率最高;颗粒细胞注射后与激活前的最佳时间间隔可在1.5～3 h,但3 h是最佳的作用时间.结果表明,(1)WCICSI可用于水牛体细胞核移植的研究;(2)水牛胞质内注射供体细胞后3 h进行激活,核移植重构胚的发育效果最好.