猪流感病毒新型核糖体移码蛋白PA-X特有序列的原核表达、纯化及鉴定

核糖体移码蛋白PA-X是流感病毒的一种新型蛋白,为了研究该蛋白对于猪流感病毒的生物学特性的影响,我们进行了PA-X特有序列的原核表达、蛋白纯化及其鉴定。通过RT-PCR和重叠PCR方法扩增PA-X特有序列的基因,利用基因重组技术构建原核表达载体,并进行菌液PCR和菌液测序鉴定,鉴定正确后克隆转化到BL21(DE3)中,进行蛋白表达及可溶性分析,同时用镍柱亲和层析法对其进行纯化。通过菌液PCR序列鉴定,PA-X特有序列的原核表达载体序列正确,编码框正确。转化BL21后目的蛋白表达成功,且大多数为可溶性蛋白。Western blot结果表明制备的多克隆抗体具有良好的免疫反应性。     

猪Sar1b基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达

为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni²⁺离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。     

猪Viperin基因丙酸诱导型载体构建及表达

本试验以猪十二指肠cDNA为模板,通过PCR、酶切鉴定克隆Viperin基因,利用非酶连接技术将其连接丙酸诱导型表达载体pEX5,经丙酸钠诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting进行表达蛋白鉴定。结果显示,成功克隆了猪Viperin基因,包括完整开放阅读框ORF,其长度为1 046bp,将扩增得到的序列成功连接到载体pEX5,构建了pEX5-Viperin;SDS-PAGE和Western-blotting。6×His-NusA-TEV-LIC-Viperin融合蛋白主要以包涵体形式表达,其相对分子质量约96 500。结果表明,pEX5-Viperin的成功构建,为后续猪Viperin蛋白的纯化,Viperin基因与病毒互作关系及信号通路调控机制的研究奠定了基础。     

中国美利奴绵羊磷脂酶Czeta基因表达载体的构建及原核表达

构建美利奴绵羊磷脂酶 C zeta（PLCζ）融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化,为其特异性抗体的制备及生物学功能研究奠定基础。用 PCR 技术扩增出 PLCζ基因片段,亚克隆到原核表达载体pCzn1中,导入 Arctic Express TM （DE3）感受态细胞,IPTG 诱导表达,收样后进行 SDS-PAGE 电泳或Western blot 检验 PLCζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法大量纯化融合蛋白。结果显示,重组质粒经 PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确。pCzn1表达载体在 Arctic Express TM （DE3）表达菌中能很好地表达融合蛋白。表达纯化后可获得了分子量约74 ku 的融合蛋白,符合预期大小。成功构建 pCzn1-PLCζ原核表达载体,表达并纯化了其融合蛋白,Western blot 试验表明其蛋白分子的完整性良好,这将有利于对 PLCζ蛋白进行深入的研究。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis type B)非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056bp,以包涵体的形式表达约40ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。