猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 |
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引用本文: | 杨文静,李玉鹏,梁冬梅,王倩,杨升,乔家运,姚胜宁,李海花.猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备[J].中国畜牧兽医,2019(9). |
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作者姓名: | 杨文静 李玉鹏 梁冬梅 王倩 杨升 乔家运 姚胜宁 李海花 |
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作者单位: | 天津农学院动物科学与动物医学学院;天津市畜牧兽医研究所;天津师范大学生命科学学院;天津市静海区畜牧水产业发展服务中心 |
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摘 要: | 试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列(GenBank登录号:XM_003124236.4)设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。
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