一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

H9亚型HP株禽流感病毒繁殖规律的探索

为了研究H9亚型HP株禽流感病毒接种非免疫鸡胚后病毒的繁殖规律,试验用H9亚型HP株禽流感病毒接种非免鸡胚,记录不同时间段死亡的鸡胚数量,并分别收获各时间段死亡鸡胚的尿囊液,测定不同时间段尿囊液的病毒效价。结果表明,接种H9亚型HP株禽流感病毒后,非免鸡胚死亡高峰期出现在60～84 h,死亡数量占接种鸡胚数的80%以上,而该时间段死亡鸡胚尿囊液的病毒滴度也处于最高峰,最高到达10^9.63EID₅₀/mL,直到96 h病毒仍维持较高水平(10^9.50EID₅₀/m L),而96 h后病毒滴度开始衰减。     

禽流感H9亚型SD696株疫苗生产工艺改进试验

分别采用10日龄和12日龄SPF鸡胚增殖禽流感H9亚型SD696株病毒,并改变后孵化温度,将死亡高峰期、最终死亡率、平均单胚收获量、尿囊液血凝价HA、病毒含量EID50进行对比,结果表明用12日龄SPF鸡胚比用10日龄SPF鸡胚增殖禽流感H9亚型SD696株病毒,死亡高峰期推迟12-24 h,最终死亡率、尿囊液的HA和EID50无差异,平均单胚收获量提高了2-3mL。35℃培养比37℃培养鸡胚死亡高峰期延迟、最终死亡率降低、平均单胚收获量提高、尿囊液的血凝价HA及病毒含量EID50偏高。选择12日龄SPF鸡胚,35℃培养温度为生产工艺,既提高疫苗产量,降低成本,又能够提高产品的质量。     

8株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定与抗原交叉保护性分析

为了探讨河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒的流行情况及抗原的差异性,试验采用病毒分离鉴定及交叉攻毒免疫保护试验对8株H9亚型禽流感病毒进行了抗原差异性分析。结果表明:利用SPF鸡胚从疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离鉴定出8株病毒,这8株病毒诱导的SPF鸡产生的HI抗体效价基本相同,能抵抗不同毒株的攻击。说明河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒流行毒株间具有较好的交叉保护力。     

悬浮培养和鸡胚尿囊液抗原制备的H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较试验

为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。     

2017年盐田区禽流感预警监测结果与分析

一、样品采集与检测项目共进行了4次检测样品采集,共采集鸡喉拭子109份分别进行禽流感病毒分离,具体情况见表1。二、检测内容及结果将鸡喉拭子样品做10000xg,4℃,15min离心处理,经0.45μm过滤器过滤除菌,经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚,3枚/份,0.1ml/枚,置37℃孵化机孵化。弃24h内死亡的鸡胚,收集并检测24h至72h的鸡胚尿囊液,进行血凝试验(HA),对HA价达2log以上胚液,分别用H5亚型禽流感HI标准血清、H7亚型禽流感HI标准血清、H9亚型禽流感HI标准血清进行血凝抑制试验(HI)。对HA检测阳性样品鸡胚尿囊液进行RNA抽提,经禽流感(H5、H7、H9)特异性引物进行RT-PCR扩增,检测结果具体情况见表2。     

朗德鹅禽流感病毒的分离与鉴定

用禽流感病毒ELISA试剂盒对某朗德鹅养殖场的病鹅气管粘液进行了检测，发现5份粘液样本均呈禽流感阳性；随后取相应气管组织材料接种于9～11日龄鸡胚分离病毒．发现尿囊液能使鸡红细胞发生凝集，用禽流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒抗血清作HI试验，结果禽流感病毒H5亚型抗血清的血凝抑制滴度达到2^7，而禽流感病毒H7、H9亚型及其他病毒抗血清无血凝抑制滴度，说明从朗德鹅分离到的病毒为H5亚型禽流感病毒。     

H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制

利用H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株进行灭活疫苗的研制,并对疫苗的免疫效果进行评价,为家禽H7N9亚型流感的防控提供科学数据及手段。将AIV-rGD76株用灭菌生理盐水作104倍稀释后,接种11日龄非免疫鸡胚,37℃孵育72h后收获感染鸡胚尿囊液,经甲醛灭活后,加矿物油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗,对制备疫苗的性状、安全性、免疫效力等进行检验。结果显示,制备的3批重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株)均为油包水型,黏度均在50cP以内,对3批疫苗取样,样品经3000r/min离心15min,管底无水相析出。安全性试验结果显示,将疫苗按1mL/只超剂量接种3周龄SPF鸡,试验鸡在观察期内全部健活,未出现局部或全身不良反应,表明疫苗对SPF鸡具有良好的安全性;免疫效力及攻毒保护试验结果显示,用疫苗按0.3mL/只的剂量免疫接种3周龄SPF鸡1次,免疫接种后21d试验鸡血清中rGD76株的HI抗体平均效价可达8log2以上,使用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD16株滴鼻接种0.2mL/只(含100LD50)对免疫鸡进行攻毒,疫苗对免疫鸡的保护率均为100%。在实验室条件下研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株),疫苗的各项指标均符合标准。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了获得H9亚型禽流感病毒(AIV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征和致病性,采用病毒分离、血凝性试验、鸡胚半数感染量(EID₅₀)测定、HA基因序列分析、致病性试验、交叉保护性试验等对3份临床疑似H9亚型AIV感染病料进行了研究。结果:3份临床病料样品可引起10日龄SPF鸡胚规律性死亡,3株分离毒株对1%鸡红细胞的凝集效价分别10log₂、11log₂和10log₂;对SPF鸡胚的EID₅₀分别为10^-8.83/mL、10^-9.50/mL和10^-9.0/mL;与2018年上海分离毒株亲缘关系较近,进化树处于同一分支;对SPF雏鸡的发病率分别为80%、100%和90%;均未引起SPF雏鸡死亡;彼此之间具有100%的交叉保护率,商品化禽流感(H9亚型)灭活疫苗对3株分离毒株的保护率分别为100%、90%和100%。本试验成功分离鉴定到了3株低致病性H9亚型AIV流行毒株,并证实当前商品化疫苗对H9亚型AIV流行毒株仍具有较好的保护效果。     

禽流感病毒H9亚型灭活油乳剂疫苗的免疫试验

以低致病性禽流感病毒（AIV）H9N2亚型株的鸡胚适应毒经尿囊腔接种10日龄鸡胚，从24h后死亡胚及96h后4℃致冷死亡胚收集尿囊液，尿囊液的血凝价约7log2，每毫长约含10^8.6个ELD50的病毒。将尿囊液经0.1%福马林灭活后，用超滤器将尿囊液浓缩5倍后分别制成双联灭活疫苗。对4周龄SPF鸡肌肉注射0.5ml或0.3ml单联H9亚型AIV灭活苗，在接种后2、3、4、5周后，血清中对H9亚型AIV的血凝抑制（HI）抗体效价分别是5.1、7.2、8.3、10log2或3.8、6.5、6.3、8.31log2。注射0.5ml的H9亚型AIV和NDV二联油乳苗的鸡，在接种后2、3、4、5周对H9亚型AIV及Lasota株NDV的HI滴度分别是4.6、5.6、6.7、8log2及7、7.6、6.7、7log2。显然，二联苗对H9亚型AIV及NDV均产生了理想的免疫效果。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

鸡血清4型禽腺病毒与HH9亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒、新城疫病毒混合感染的鉴定

试验对临床疑似血清4型禽腺病毒与H9亚型禽流感、新城疫混合感染鸡的病例进行了病毒分离与鉴定。通过接种鸡胚、血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验、PCR鉴定,确定该病例为三种病毒混合感染。动物回归试验证明,1 000 ELD_(50)病毒量对2日龄SPF鸡致死率达到100%,剖检病变呈现典型心包积液-肝炎综合征,而H9亚型禽流感和新城疫病变特征不明显,说明混合感染中血清4型禽腺病毒病变非常典型,H9亚型禽流感和新城疫则呈现非典型病变。     

鹅禽Ⅰ型副粘病毒病的快速鉴别诊断

用禽流感免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽流感或禽Ⅰ型副粘病毒感染的鹅病例,结果为禽流感阴性;取病鹅肝、脾混合病料进行病毒分离,分离鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞(RBC),HA滴度为6 log2,并可被康复鹅血清、抗鸡新城疫(NDV)阳性血清所抑制,而不能被禽流感(H5、H9)标准阳性血清抑制。分离病毒人工感染易感雏鹅,引起100%的发病和死亡,并有与自然病例相似的症状和病变;人工感染42日龄SPF鸡出现100%的发病和死亡。根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定,证明该鹅群患禽Ⅰ型副粘病毒病。说明用禽流感免疫胶体金试验可以实现对禽流感、禽Ⅰ型副粘病毒病的快速鉴别诊断。     

禽流感病毒单克隆抗体的研制

用低致病性禽流感病毒H9N2亚型(Mildly Pathogenic Avian Influenza Virus,MPAIV)F株全病毒作为抗原,制备能够用于建立ELISA检测AIV的特异性单抗;以间接ELISA和HI试验筛选出阳性克隆,并经有限稀释法三次亚克隆之后,共获得三株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,在Dot-ELISA试验中三株单抗中的两株与13个AIV H9N2国内分离株、4个AIV H5N1国内分离株都反应,而与10个NDV国内分离株,IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.一株与13个AIV H9N2国内分离株反应,与4个AIV H5N1分离株、NDV、IBV、IBDV、EDSV-76、SPF鸡胚尿囊液不反应.     

呼吸道病型H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

广东省某鸡场发生一起以严重呼吸困难症状、急性死亡为特征的病例,5 000羽122日龄清远麻鸡在一周内连续死亡400多羽。剖检后几乎所有病死鸡支气管充满干酪样物质,导致支气管严重阻塞,气管及支气管黏膜严重出血。病料接种SPF鸡胚绒毛尿囊膜获得一株病毒。通过AGP试验,该病毒能与禽流感标准阳性血清形成明显沉淀线;通过HA试验,该病毒能够凝集鸡红细胞,但此血凝现象不能被抗NDV血清、抗EDSV-76血清、抗H5亚型流感单因子血清、抗H7亚型流感单因子血清所抑制,而能被抗H9亚型禽流感单因子血清所抑制;进而通过RT-PCR方法,最终确诊该病毒为H9亚型禽流感病毒。动物回归试验,攻毒鸡表现与临床发病鸡一致的症状及病理变化,并能再次分离到该病毒。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

鸡传染性支气管炎病毒LH2/01/10的分离鉴定

2001年在我国黑龙江省某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡群中，分离到一株病毒，将该病毒接种10日龄SPF鸡胚，取72h的尿囊液进行电镜观察并用1％胰酶处理，结果发现尿囊液中存在典型的冠状病毒，用胰酶处理过的尿囊液能凝集SPF鸡的红细胞，初步鉴定为鸡的传染性支气管炎病毒。将该病毒尿囊液再次接种10日龄SPF’鸡胚，通过病毒对鸡胚的致病作用、病毒超微形态特征以及病毒凝集鸡红细胞的特性等对该毒株进行研究，结果表明：经胰酶处理后的病毒尿囊液可凝集鸡红细胞。鸡胚的第二代病毒尿囊液(命名为LH2,／01／10)分别接种1日龄和15日龄的SPF鸡，发现对不同日龄的鸡表现不同的致病性，对1日龄接种鸡和同笼饲养的同居对照鸡致病力高，发病率为11／11，致死率分别为4／6和2／5；15日龄接种和同居感染鸡发病率为9／9，致死率分别为1／5和1／4。实验应用反转录一聚合酶链式反应技术对LH2／01／10的膜蛋白基因进行扩增、克隆和序列测定，结果表明该基因具有IBVM基因的共有分子特征．与IBV标准株M41的M基因核苷酸的同源性为90％，氨基酸的同源性为91％。这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

H5亚型禽流感病毒不同毒株及抗原含量对灭活疫苗效果的影响

本试验针对禽流感病毒(AIV)不同毒株及抗原含量的灭活疫苗对仔鸡保护性的影响作了探讨.数组4周龄的鸡分别用10种H5亚型、一种异源H7亚型及正常鸡胚尿囊液制备的疫苗进行免疫,3周后滴鼻感染高致病力H5亚型AIV.结果所有10种H5亚型疫苗对鸡在临床症状及死亡率上表现了较好的保护力,AGP及m抗体阳性.实验1中H5亚型疫苗免疫组80%的鸡体口咽部可分离到病毒,其中5个免疫组在鸡体泄殖腔中没有查到病毒,其它5组,泄殖腔中有病毒分布的鸡体数量明显低于正常尿囊液免疫组,与之相比,有些H5亚型疫苗免疫组中鸡泄殖腔及口咽部病毒分布的数量也明显减少,但减少的程度与疫苗株与攻毒株的HA基因序列同源性之间并不存在正相关,随疫苗中所含病毒含量的递增,各项与保护性相关参数增大的幅度因疫苗毒株的不同而改变.     

威力劲碘杀对H5和H9亚型禽流感病毒的杀灭作用试验

采用悬浮杀灭实验,以鸡胚感染法,研究威力劲碘杀在1500、11000、12000、13000的系列浓度下,与禽流感病毒亚型H5和H9病毒悬液作用30分钟,对禽流感病毒亚型H5和H9的杀灭实验。1500、11000、12000、13000的威力劲碘杀与H5亚型禽流感病毒作用30分钟,其杀灭率分别为100%、100%、100%、81.67%;与H9亚型禽流感病毒作用30分钟,其杀灭率分别为100%、100%、100%、90.00%。     

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖(sulfated polysaccharide from algae,SPA)及中药复方提取液(compound extracts of Chinese medicine,CECM)对H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价(P0.01),以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组(200mg/mL)的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组(12.5、25和50mg/mL)及CECM低、中剂量组(50和100 mg/mL)(P0.05);治疗作用组,SPA高剂量组(50 mg/mL)及CECM中、高剂量组(100和200mg/mL)抗病毒效果显著优于SPA低剂量组(12.5mg/mL)(P0.05);直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著(P0.01)。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。