禽类生殖嵌合体的制作及其应用

目前已能够运用禽类囊胚细胞 (BCs)或原生殖细胞 (PGCs)制作嵌合体。为了提高生殖嵌合体的制作效率 ,已有许多方法被采用。最近的研究表明 ,对BCs或PGCs进行同性别移植也可以提高生殖嵌合的制作效率。BCs和PGCs体外培养的成功使得嵌合体技术能够应用于禽类转基因中 ,并且 ,还可应用于珍稀鸟类的保种     

鸡鸭异种间转基因嵌合体的制备

为研究异种间嵌合体的制作方法及供体和受体的嵌合情况,同时探讨绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因作为报告基因在转基因动物制作中的应用价值。本研究利用脂质体介导法将外源pEGFP-N3质粒转入到北京鸭原始生殖细胞(PGCs)中,将转染后的PGCs以微注射法转移至受体北京油鸡的胚下腔,探索转基因鸡鸭嵌合体的制作方法。结果显示:PGCs在转染后6 h开始有外源基因的表达,体外培养24 h后获得了33.6%的转染效率。120枚蛋在整个孵化期中共有33枚鸡胚发育,但最终无孵化成活鸡。在13个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为10.8%。PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,8只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞。研究结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因禽类是可行的。鸭PGCs能够迁移并定居到鸡胚性腺中,并有可能在鸡性腺中增殖分化成有功能的配子。     

禽类嵌合体技术及其在转基因中应用的研究进展

本文综述了禽类以囊胚层细胞（ＢＣ）和原生殖细胞（ＰＧＣ）为供体细胞的嵌合体制作技术及其在禽类转基因中应用的研究进展。嵌合体技术作为禽类转基因的手段之一具有诸多优点。迄今，禽类ＢＣ和ＰＧＣ为供体细胞的嵌合体制作，体细胞和种系嵌合程度分析的方法已建立，且具有较高的操作成功率和准确性。嵌合体性别分化规律和繁殖机能已作了初步研究。嵌合体技术应用于禽类转基因的方法路线已建立，导入外源基因的供体细胞在形成嵌合     

禽原始生殖细胞的研究进展

原始生殖细胞(PGCs)是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。早期胚胎的PGCs适用于各种各样的研究,包括用于发育生物学研究、药理研究、移植治疗、性腺嵌合体制备、转基因动物生产等。禽肉与禽蛋产品是人类蛋白质摄入的重要来源,将禽PGCs用于禽类繁殖和生命科学研究等领域有着广阔的应用前景。文章阐述了禽PGCs的起源与迁移、体外培养方法及应用。     

胚胎干细胞及种系嵌合体的研究进展

胚胎干细胞是着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞经体外分化抑制培养建立的多能性细胞系 ,具有与胚胎细胞相似的形态特征和分化潜能 ,体外培养时保持未分化状态 ,可以传代增殖。改变维持胚胎干细胞不分化的培养条件 ,胚胎干细胞可自发分化成多细胞结构。在一定诱导下 ,胚胎干细胞可向多个方向分化 ,并生成多种功能细胞。胚胎干细胞注入到胚泡期胚胎或与桑椹期胚胎聚合 ,可以参与包括性腺在内的各种组织的嵌合体的形成。胚胎干细胞在细胞分化与调控 ,胚胎发育 ,遗传病 ,肿瘤 ,免疫和组织或器官移植等研究中显示着广泛的应用前景。而种系嵌合体的获得是实现 ES细胞途径的决定步骤 ,低的种系嵌合率则是制约 ES细胞应用的关键。提高供体 PGCs在受体生殖腺中的比例 ,缩短 ES细胞的体外培养时间 ,以及注入早期发育阶段的受体胚胎等都能提高种系嵌合率。文章从多个方面综述了胚胎干细胞的最新研究成果 ,并着重以禽类 ES细胞为例论述了种系嵌合体的检测方法 ,种系嵌合率的影响因素以及提高种系嵌合率的方法     

供体PGCs在鸡-鸭嵌合体胚胎性腺外的发育

通过微注射法将鸡原始生殖细胞 (PGCs)注入到鸭的胚盘下腔中 ,用鸡 W染色体 DNA探针通过原位杂交的方法对供体 PGCs在嵌合体胚胎性腺外的发育作了研究。结果表明 ,所取的 4 8枚胚胎中 ,有 18.8%的脑内和 2 3.9%的神经管周围出现了阳性信号     

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索

分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。     

禽类胚胎体外培养的研究进展

禽类胚胎的发育过程不同于哺乳动物,胚胎发育至囊胚阶段后随种蛋产出体外,然后在蛋壳内完成整个生长发育过程,不利于直接观察胚胎的连续发育过程,也不利于对胚胎进行遗传操作。因此,一个有效的禽类胚胎体外培养技术将为禽类胚胎操作技术提供广阔的前景。1禽类胚胎体外培养的研究概况自20世纪80年代以来,许多研究者都尝试将转基因鸡作为生物反应器来生产药物蛋白[1-3]。家禽的世代周期短,生产性能高,最适合转基因技术的应用。有多家欧美公司宣布,它们研究出了鸡蛋中含有人体蛋白的转基因鸡的新方法。这一研究结果表明,通过鸡生“蛋”而生出药物是可行的。但是禽类与哺乳动物胚胎发育有很多的不同点,胚胎与配子工程始终落后于其他动物[4]。禽类的卵子含有大量的卵黄,排卵后在母体输卵管内进行卵裂,经过24h排出体外时胚盘中含有6万个细胞,此后在完全独立的蛋壳中完成胚胎发育过程直到出生。由于禽类所特有的生殖特点:不易获得大量的受精卵;受精时多精入卵;卵子重新回到母体输卵管内的技术或受精卵体外孵化技术难度大等,客观上制约了业已在哺乳动物中普及的转基因技术在禽类遗传操作上的广泛应用。自然状态下,禽类胚胎发育由单细胞形成个体分为两个阶段,即体内的输卵管...     

鸡胚盘细胞的研究进展

鸡胚盘细胞存在于未孵化的新鲜种蛋中，是一种具有多潜能性的胚胎干细胞。通过胚盘细胞移植法可制备体细胞或种系细胞嵌合体。如果将外源基因转入受体胚盘，受体胚后代则可能成为转基因鸡。利用胚盘细胞作为转基因载体，生产转基因鸡是研究禽类转基因的一种理想方法。作者就胚盘细胞及其研究进展给予综述。     

禽类原始生殖细胞的研究进展

原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是指能发育为精子或卵子的祖先细胞,1870年首先在鸡胚的生殖腺中发现.作为一种多能性细胞,PGCs具有很高的研究价值,已成 为国内外研究的热点.基于目前国内外对PGCs的研究情况,本文就禽类PGCs的起源 与迁移、分离、培养、特性鉴定以及应用等研究现状及进展作一综述.     

鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养

旨在对影响鸡胚胎原始生殖细胞（PGCs）体外培养、传代过程的各种影响因素进行探讨。将分离到的19期鸡胚胎生殖腺的PGCs在以鸡胚成纤维细胞（CEF）为饲养层，添加细胞因子的培养体系中进行培养、传代。经冷冻保存的PGCs在添加细胞因子的培养体系中能增殖，并具有分化能力。从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定等方面对培养过程中的鸡胚胎PGCs进行检测。结果表明，采用传至3代的CEF为饲养层，多次离散法进行传代所获得的5代鸡胚胎PGCs不但能有效维持PGCs的未分化状态和正常二倍体核型，也具有其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。     

鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展

本文介绍了禽类胚胎操作技术方面的概况，对受精卵收集及体外受精、早期胚胎体外培养、人造材料蛋壳培养胚胎、代用蛋壳培养胚胎、嵌合体鸡的生产、转基因鸡生产等的进展及发展进行了综述。     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

昆明小鼠内细胞团和滋胚层细胞注入去核2-细胞胚的核移植研究

采用核移植技术将单个细胞注入去核2-细胞卵裂球中,比较来自于囊胚的内细胞团(ICM)和滋胚层细胞(TE)产生孕体或嵌合体的发育潜力。用TE和ICM重构胚胎的发育潜力,主要取决于注射hCG后从输卵管收集到的2-细胞胚胎的时间。在注射hCG后38～42 h和43～46 h收集得到的2-细胞胚胎,其重构胚胎仅仅能够发育到4-细胞期。注射hCG后48～51 h收集得到的2-细胞胚胎,重构后发生卵裂的胚胎比率显著提高,有少部分会发育到囊胚期。用诺考达唑(Nocodazole)处理这些重构胚,发生卵裂的胚胎比率会显著提高,并且有部分重构胚发育到囊胚阶段。将这些囊胚移植到受体鼠中,在其妊娠中期未检测到供体核的出现。用ICM和TE进行重构得到的嵌合2-细胞胚胎,其体外发育潜力有限,本试验中也未得到嵌合孕体。     

猪原始生殖嵴细胞(PGCs)建系因素的研究

从五指山猪(WSZP)近交系第8～13代培育群中，先后选用21头5～10月龄青年母猪，分别于授精后25～30d采集胎儿106个，进行原始生殖嵴(PGCs)细胞分离、培养等建系技术研究。以DMEM F10(1:1)为基础培养液，按添加或不添加生长因子，将培养液分为A、B、C3种，并以STO细胞作饲养层，在38℃、5.0％CO2和湿润的气相中进行培养建系。结果获得胚胎生殖嵴细胞(EG)细胞系6个细胞株，其中1个EG细胞株传至11代、2个传至5代、1个传至4代、2个传至3代冻存。并进行了AKP染色、体外分化、冷冻-解冻复苏和嵌合体制作等鉴定研究。研究发现：不同胚龄对EG细胞建系具有一定影响，不同培养液对EG细胞建系效果不同，STO细胞饲养层的质量是建株、传代、冷冻-解冻复苏的关键因素之一。EG细胞系的初步建立，为今后筛选进入种系的EG细胞系、实施体外基因操作提供了可能。     

鹌鹑PGCs的传代培养及鉴定

试验采用鸡胚胎制作的成纤维细胞饲养层培养细胞,成功实现鹌鹑原始生殖细胞(PGCs)的传代培养;并通过对比试验,验证了生长因子LIF、SCF、bFGF能够显著提高PGCs存活率和抑制其分化。     

转移早期囊胚期细胞制备的嵌合体鸡

用显微注射方法将尼拉商品鸡鸡胚X期细胞液注入同期海兰鸡的囊胚腔中，再经体外培养至出雏，获得尼拉--海兰嵌合体鸡，嵌合体率为5%（3/60），出雏率为15%（9/60）。另一项实验是将受体鸡胚经过600rad^60Co辐射处理后再注入供体细胞并体外培养至出雏，结果嵌合体率为14.0%(8/57），孵化率为15.8%(9/57），其中两只毛色嵌合体公鸡存活至今已经8个月。嵌合体鸡的黑色羽毛可出现在多个部位，有两只鸡的腿部和喙的角质也出现黑色斑。嵌合体鸡血液DNA具有供体鸡的特征带。本研究为进一步制备转基因鸡奠定了基础，也为鸡的发育生物学研究和遗传学研究提供了实验材料。     

禽类实验动物发展的影响因素及对策(一)——国内外禽类实验动物的研究概况

从1789年Pasteur用鸡研究鸡霍乱开始,鸡作为实验动物已有几百年的历史,通过鸡验证了孟德尔的遗传定律,成功地研制出人类的第一个抗癌疫苗—鸡的马立克氏病疫苗。以鸡为代表的禽类实验动物具有繁殖快、卵生,体外孵化容易控制,试验成本低,一次可获得大量的鸡胚和胚胎细胞的特点,同时在胚胎期,鸡的免疫系统发育不全,鸡胚和鸡胚细胞适宜做多种病毒的培养基,用于禽病的病原学、流行病学、病理学和用于制备禽病诊断的检测试剂和疫苗生产等,用于疫苗的安全性及效力检验等,使禽类实验动物的应用十分普及。1国外禽类实验动物研究进展美国、日本、法…     

对鸡的原生殖细胞冻存后重建种群的研究

在家禽面临意想不到的疾病(例如禽流感)大流行时,或者不喜爱某些家禽产品的时候,(冷冻)保存现有种群的遗传多样性,并在未来通过回交重新建立种群,是家禽业生物安全保障、预防禽种(特别是珍稀品种)遗传资源减少或流失的关键措施。从单个供体鸡胚胎(阶段16,孵化2.5d)的背侧主动脉抽出血液,体外培养原生殖细胞(PGCs)、冷冻保存。若干年之后,解冻PGCs、体外培养使其苏醒。将PGCs注入寄主鸡胚胎(阶段16,孵化2.5d)背侧主动脉,继续孵化至出雏,有些后代鸡就会携带供体鸡的遗传基因。通过繁殖扩大数量,就可重新建立供体鸡种群。     

胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

旨在为小鼠和猪多能性干细胞嵌合体制作提供参考,探讨胚胎干细胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells,ES/EG)显微注射及受体胚胎发育时期等对胚胎发育的影响。对小鼠ES细胞和猪EG细胞分别进行研究:(1)将小鼠ES细胞分别注入小鼠桑椹胚和囊胚,比较不同发育时期受体胚胎体外培养的发育率和孵化率,以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的发育率和孵化率。结果表明,显微注射后的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%和70.2%,囊胚率分别为84.6%和80.8%,注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P0.01),但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P0.01);未注射胚胎(注射胚胎)的体外培养发育率和孵化率分别为96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%),未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P0.01),但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P0.01)。(2)将猪EG细胞分别注入猪桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚,比较不同发育时期受体胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的孵化率,并对猪EG细胞显微注射针和固定针的规格进行了探讨。结果表明,显微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率为67%,而显微注射的孵化囊胚移植妊娠率为0,桑椹胚、早囊及囊胚移植后受体母猪妊娠率极显著高于孵化囊胚(P0.01),由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植获得了两头嵌合体仔猪;显微注射和未显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%,未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P0.01)。确定猪EG嵌合体制作过程中,注射针外径约为30μm,内径约为25μm;固定针外直径约为130~150μm,内径约为40μm。嵌合体制作时,胚龄宜早不宜迟,桑椹胚显微注射更易操作,而且导入的时期较早,ES/EG细胞在嵌合体组织中可以有很高的贡献率,故选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下,显微注射对小鼠胚胎发育影响不大,对猪胚胎影响较大,说明猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。