鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定

从发病率颇高的产蛋鸡群和死亡率达３０％以上的肉鸡群病例中，先后分离到６株Ａ型禽流感病毒。这些分离株可在鸡胚中传代。可以凝集鸡红细胞而不被新城疫阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成的ＡＧＰ抗原与禽流感阳性血清在ＡＧＰ试验中出现白色的沉淀线。用ＡＩＤ９３～１分离株与１５个标准ＨＡ亚型和９个标准ＮＡ亚型的标准血清进行ＨＩ试验，结果鉴定出ＡＩＤ９３～１毒株的血清亚型为Ｈ９Ｎ３。其余５个分离株均可被ＡＩＤ９３－１株的高免血清所抑制。人工复制病例出现明显的临诊症状，可缓慢康复，不引起死亡。用日龄较小的ＡＡ鸡与攻毒鸡同居能感染发病，并引起１／５死亡。健康产蛋母鸡与发病鸡群同场饲养也可感染发病，并引起产蛋下降。这些分离株具有良好的免疫原性。通过电镜观察符合流感病毒的形态特征，病毒粒子的直径为８０～１２０ｎｍ。     

中国禽流感流行株的分离鉴定

分别从广东、四川、新疆等地禽流感（ＡＩ）血检阳性、发病率高、产蛋率下降的鸡群中采集１８６份病料，先后分离到６株Ａ型流感病毒。这些分离株可在鸡胚中传代，可凝集鸡红细胞，血凝价达１６０～１２８０倍。不被新城疫、减蛋综合症、败血支原体阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成琼脂扩散（ＡＧＰ）抗原与禽流感标准阳性血清可出现白色沉淀线。分别将分离毒株与ＡＩ标准分型血清Ｈ１～Ｈ１４、Ｎ１～Ｎ９进行ＨＩ、ＮＩ试验，结果川和川农株均为Ｈ４Ｎ６，西昌１和２株及Ｓｈ株均为Ｈ９Ｎ２，新疆石河子（石）株为Ｈ１４Ｎ５。分离株分别做脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）、静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）测定，结果所有分离株ＩＣＰＩ介于０２４～１４８之间，ＩＶＰＩ介于０１５～０５６之间．通过电镜观察，可见直径为８０～１２０ｎｍ球状或杆状典型的禽流感病毒．经联机检索，从新疆石河子ＡＩ阳性鸡场产蛋下降的鸡群中分离出的Ｈ１４Ｎ５株为国内外首次从鸡中分离出的Ｈ１４亚型禽流感病毒。将某单位送检的禽流感鹅体分离株（Ｇ１株和Ｇ２株）做了血清型和毒力测定，试验结果认定，Ｇ１和Ｇ２株均为Ａ型禽流感病毒Ｈ５Ｎ１亚型，Ｇ１、Ｇ２株对鸡均达到高致病力毒株标准。     

禽流感的药物防制

禽流感（ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ简称ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类和鸟类的感染和疾病的综合征。１８７８年该病在意大利鸡群暴发的一种严重疾病，直至１９５５年美国才分离到Ｈ５Ｎ１流感毒株。近年在美洲、欧洲、非洲、亚洲、澳洲等地时有暴发，已分离到上千株ＡＩＶ毒株，病毒可分为不同的亚型，我国在８０年代从鸭分离到亚型有Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ６，香港在１９７５～１９８０年分离到６２种亚型Ｈ１～１１和Ｎ１～９的组合。禽流感对鸡可直接或间接感染，如鸡、火鸡、鹌鹑、水禽和海鸟等均可感染。水禽…     

禽流感病毒人工感染鸡抗体的监测及血凝素分型血清的制备

从英国中心兽医实验室（ＣＶＬ）引进禽流感病毒１４种血凝素亚型（Ｈ１～Ｈ１４）的标准毒株,经９～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚增殖、传代后收取感染鸡胚的羊水及尿囊液,经１０００ｘｇ离心１５分钟后,收取上清作为免疫原。取８只１２周龄ＳＰＦ鸡分成Ａ、Ｂ两组,进行人工感染鸡的抗体消长规律试验。选用Ｈ３毒株制备的免疫原,按１ｍｌ／只的剂量翅静脉接种Ａ、Ｂ两组的８只ＳＰＦ鸡,１周后Ｂ组的４只鸡复免一次,分别用ＨＩ和ＡＧＰ试验测定２种方法免疫鸡的抗体水平．监测结果表明：经１次免疫的鸡（Ａ组）于免疫后１５天ＨＩ抗体升至最高,以后抗体逐渐下降,且产生的抗体个体差异不大,ＡＧＰ试验结果只有于免疫后２０～５５天内全部为阴性;经重复免疫的鸡（Ｂ组）,于初免后１５～４５天内ＨＩ抗体都维持较高水平,且产生的抗体个体差异不大,ＡＧＰ试验结果在初免疫后１５７５天内全部为阳性。据此,我们根据禽流感病毒株毒力的强弱（参照其ＥＩＤ５０,用纯化后的鸡胚尿囊液制备的免疫原,按０５～２５ｍｌ／只的剂量分别免疫１２周龄ＳＰＦ鸡,１周后加强免疫一次于二免后１０～１５天放血,制备出禽流感病毒１４个血凝素亚型的分型血清,并有霍乱滤液（ＲＤＥ）法对血清进行了处理。     

RT-PCR快速诊断禽流感

根据禽流感病毒ＮＰ基因的序列分析结果,设计了一对ＮＰ基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, ＲＴ～ＰＣＲ可以扩增出 ３２６ｂｐ的 ＮＰ基因片段。采用该技术对１４个亚型禽流感病毒标准参考株,４个亚型１２株国内分离野毒株,ＲＴ－ＰＣＲ检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（Ｈ５Ｎ１）和 Ａ／Ａｆｒｉｃａｎ　Ｓｔａｒｌｉｎｇ／Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈ７Ｎ１）实验感染鸡样品 ＲＴ－ＰＣＲ检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为３４／４２、３２／４２; ２４／５５、２４／５５, 二者符合率大于９５％。 ＲＴ－ＰＣＲ最少可检测到１０ｐｇ的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行ＲＴ－ＰＣＲ检测,只用６个小时就可得出准确的诊断结果,证明ＲＴ－ＰＣＲ检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。     

禽流感抗体斑点—ELISA诊断技术的研究

以混合纤维素酯微孔滤膜为固相载体,用自制的禽流感全病毒抗原和酶标抗体,建立了禽流感抗体斑点 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测法,其抗原最适包被量为 ０．０６μｇ／点;血清抗体最佳稀释度为 １１００;酶标抗体作 １２００ 稀释;出现明显清晰的斑点者判为禽流感抗体阳性。该方法对 Ｓ Ｐ Ｆ鸡血清及新城疫、传染性法氏囊病等其它 １１ 种鸡疫病阳性血清均为阴性,对不同亚型特异性的禽流感病毒（ Ａ Ｉ Ｖ）分型血清、琼扩（ Ａ Ｇ Ｐ）阳性血清及血凝抑制（ Ｈ Ｉ）阳性而 Ａ Ｇ Ｐ疑似的血清样品均呈阳性;对人工接种 Ａ Ｉ Ｖ 的 Ｓ Ｐ Ｆ鸡第 ３ 天即能检出抗体阳性,第 ５～１１７ 天可全部检出。与间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 法比较,不仅其特异性、敏感性、重复性相一致,而且结果可用肉眼判定,更适合现地禽流感抗体监测及流行病学调查。     

禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性

禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。     

禽流感病毒核蛋白基因探针制备

中国农业大学动物医学院吴清民、高齐瑜等将禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型毒株核蛋白（ＮＰ）基因３’端较为保守的，约３５０ ｂｐ的编编序列通过限制性内切酶ＨａｅⅢ切割、分离后，用随机引物法制备 Ｄｌｇｏｘｉｇｅｎｉｎ　－１１－ｄｕＴＰ标记探针。测定该探针的浓度为１００μｇ／ｍＬ。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有ＮＰ基因的重组载体ＰＧＥＭ－ＴＥ－ＮＰ和ｐＢａｃＰＡｋ－ＮＰ以及Ａ到流感病毒Ｈ９Ｎ９型、Ｎ３Ｎ２亚型以及Ｈ９Ｎ３亚型毒株基因组ＲＮＡ结合出现特异性的颜色反应，而与实验室常用的载休ｐＧＥＭ－Ｔ…     

禽流感的防制

禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ简称ＡＩ)是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类和鸟类的感染和疾病的综合征。 1878年该病在意大利鸡群暴发的一种严重疾病 ,直至 195 5年美国才分离到Ｈ5Ｎ1流感毒株。近年在美洲、欧洲、非洲、亚洲、澳洲等地有暴发 ,已分离到上千株ＡＩＶ毒株 ,可将病毒分为不同的亚型 ,我国在 80年代从鸭分离到病毒亚型有Ｈ4、Ｈ5、Ｈ6等 ,香港在 1975～ 1980年分离到 6 2种亚型 ,有Ｈ1-11和Ｎ1-9的组合。禽流感对鸡可直接或间接感染 ,如鸡、火鸡、鹌鹑、野鸟、水禽和海鸟等均可感染。水禽一般不显症状 ,其他禽类可表现…     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

中国禽流感流行株的分离鉴定

分别从广东,四川,新疆等地禽流感血检阳性,发病率高,产蛋率下降的鸡群中采集１８６份病料,先后分离到６株Ａ型流感病毒。这些分离株可在鸡胚中传代,可凝集鸡红细胞,血凝价达１６０－１２８０倍。不被新城疫,减蛋综合症,败血支原体阳性血清所抑制。用这些分离毒株制成琼脂扩散抗原与禽流感标准阳性血清可出现白色沉淀线。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

禽流感病毒河北株的分离鉴定

禽流感（Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）是由 Ａ型流感病毒引起的一种禽类的病毒性传染病,被国际兽疫局确定为Ⅰ类烈性传染性病。该病毒属正粘病毒科,几乎所有的野生与家养禽类均可感染。１８７８年在意大利的鸡群中首次暴发,其后许多国家和地区都相继报道ＡＩＶ存在的事实,近几年,我国在不同地区都分离到禽流感病毒,广泛存在的主要是Ｈ９亚型病毒,且多为中等以下毒力的毒株。本试验采集病料主要针对河北省养鸡业较为发达的几个县市的七个小型养鸡场,选择未注过流感疫苗,临床症状出现产蛋下降和呼吸道症状严重的鸡只,剖杀,采集病变明显的脏器,如胰、肝、肺、脾、气管、肾、泄殖腔及其干酪样物等,剪碎研磨,加抗生素处理后,接种９－１０日龄鸡胚,弃掉２４小时内死亡的鸡胚,收集２４－７２小时死亡鸡胚的尿囊液,盲传三代,并做血凝试验,对于ＨＡ阳性的样品,进一步做ＨＩ试验,结果有２株禽流感病毒为Ｈ９亚型;进一步测定其神经氨酸酶活性,结果为Ｎ２。取１： １０稀释的尿液０．２ｍｌ肌肉接种８只８周龄ＳＰＦ鸡测其致病力指数,观察１０天内鸡只发病情况,结果第三天鸡群精神稍有沉郁,其中一只出现歪脖的神经症状,采用英国中心兽医实验室静脉致病指数（ＩＶＰＩ）测定计算方法     

禽流感的预防与控制预防与控制

禽流感是由Ａ型流感病毒引起的一种急性高度接触性传染病，一年四季均可发生，但以冬季和春季较为严重；各种龄期的鸡只均易感，但以４０天龄左右的肉鸡、产蛋高峰期的种鸡和商品蛋鸡较常发生。一流行特点１．血清型多：禽流感病毒属于Ａ型正粘病毒科的流感病毒属，该病毒表面抗原分为血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ），容易变异，是特异性抗原。现已知道ＨＡ抗原有１４种（Ｈ１～Ｈ１４），ＮＡ抗原有９种（Ｎ１～Ｎ９），两者之间可以构成若干血清亚型，各型之间无交叉保护，因此消灭此病难度较大。２．毒株间毒力的差异和变异：禽流感…     

禽流感,警钟已呜,亟待防范

禽流行性感冒简称禽流感，在世界上不少国家流行。我国陈伯伦等（１９９４）从发病鸡群中采取病料，先后分离到六个毒株。通过血清学、人工发病等试验，鉴定为Ａ型禽流感病毒，属ＨＡ亚型Ｈ９。在国内首次证实广东省有禽流感流行，并首次从发病鸡群中分离到Ａ型禽流感病毒。从而敲响了禽流感的警钟。如不予以足够重视，不尽快制定防范措施，不抓紧采取适合国情的防制办法，就很有可能在不长的时间内播及全国，将使养禽业又受到一次比     

H_5和H_7亚型禽流感病毒HA基因的RT-PCR扩增及克隆

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，以自行设计的Ｈ７和Н５亚型禽流感病毒血凝素（ＨＡ）基因特异的两对引物，分别扩增了禽流感病毒Ａ／ＡｆｒｉｃａｎＳｔａｒｌｉｎｇ／９８３／７９（Ｈ７Ｎ１）株和Ｇ株（广东鹅体分离株，Ｈ５Ｎ１）约１．７ｋｂ的ＨＡ全基因ｃＤＮＡ。将所扩增的两个基因ｃＤＮＡ未端经Ｔ４ＤＮＡ聚合酶修饰后分别插入ｐＵＣ１８和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒中，得到了两个基因的重组质粒。本研究为国内禽流感病毒分子生物学研究奠定了基础     

禽流感病毒核蛋白基因探针制备及其初步应用

将禽流感病毒Ｈ９Ｎ２ 亚型毒株核蛋白（ＮＰ）基因３′端较为保守的、约３５０ｂｐ 的编码序列通过限制性内切酶ＨａｅⅢ切割、分离后,用随机引物法制备Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ１１ｄＵＴＰ标记探针。测定该探针的浓度为１００μｇ／ｍ ｌ。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有ＮＰ基因的重组载体ｐＧＥＭＴＥＮＰ和ｐＢａｃＰＡＫＮＰ以及Ａ 型流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型、Ｈ３Ｎ２ 亚型以及Ｈ９Ｎ３ 亚型毒株基因组ＲＮＡ 结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体ｐＧＥＭＴ ｅａｓｙ、ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ ３、ｐＴＡＲＧＥＴ 和ｐＧＥＭＥＸ２ 以及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒基因组不发生反应。应用该探针检测含ＮＰ基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。     

山羊关节炎－脑炎琼扩诊断抗原的研制

通过对不同的毒株、不同细胞及不同抗原制备方法比较，选用国内分离的山羊关节炎－脑炎（ＣＡＥ）毒株ＧＳ－３５接种山羊滑膜细胞（ＧＳＭ）或角膜细胞（ＧＣ）繁殖病毒，ＰＥＧ１００倍浓缩，乙醚处理后制备琼扩（ＡＧＩＤ）抗原。用该抗原对已知不同种类阳性血清以及人工ＣＡＥ病毒感染羊的检测，证明该抗原性能稳定、特异性好，其结果与国外引进的参考阳性抗原一致。     

禽血清网状内皮组织增殖病毒抗体的检测

采集日本不同地区的鸡和其它禽类的血清检测网状内皮组织增殖病毒抗体琼脂凝胶免疫扩散试验的结果为：５４个鸡场中的２５．９％、１２６个鸡群中的２１．４％、１８９２只鸡中的１４．３％为阴性，所有ＡＧＩＤ阳性血清在间接免疫荧光或病毒中和试验中也为阳性，其它禽血清ＡＧＩＤ试验阳性结果为，北京鸭（１／１２０）和雉鸡（４／２７）。     

鸽新城疫野毒株的分离及生物学特性研究

对分离的Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３３株鸽新城疫病毒进行了电镜检查、致病性指数测定、血凝试验（ＨＡ）,与鸡新城疫Ｌａｓｏｔａ毒株的交叉血凝抑制试验（ＨＩ）、致病性试验。测得鸡胚半数感染量（ＥＩＤ５０）分别为１０－８．４１,１０－７．５３,１０－７．８３;鸡胚最小致死量（ＬＤ）均为１０－４;鸡胚平均致死时间（ＭＤＴ）分别为８０ｈ,９０ｈ,９６ｈ;１日龄雏鸡脑内致病指数（ＩＣＰＩ）分别为１．６０,１．５０,１．５５;分离毒株与Ｌａｓｏｔａ毒株和其相应血清的交叉凝集抑制试验有明显差异。将分离毒株分别接种１月龄鸽各３只,４～１０ｄ全部出现典型神经症状,１５ｄ内死亡。结果表明所分离的３株病毒为鸽新城疫病毒,在抗原性上与鸡新城疫病毒存在一定差异,对鸡也有一定致病力。为制定防制措施,研制鸽新城疫疫苗,控制新城疫流行提供了科学依据。