中国水仙NtSTK基因的克隆、序列和组织表达分析

MADS-box基因在植物花发育中发挥着重要的作用。为了研究D类MADS-box基因在中国水仙花发育中的功能,本实验采用RACE和RT-PCR技术从中国水仙‘金盏银台’中分离到1个MADS-box基因,命名为NtSTK。该基因含有1个705 bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,并且该基因在3个不同类型的中国水仙中序列差异较小。系统进化树显示NtSTK属于D类MADS-box基因。荧光定量分析表明该基因在‘金盏银台’和‘玉玲珑’的雌蕊和子房中表达水平较高,在根和叶片中低水平表达,在花被和雄蕊及鳞茎中不表达。     

多花水仙HDS基因cDNA全长克隆与序列分析

以‘黄花水仙2号’和‘金盏银台’为材料,水仙各自花瓣的cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆出2个HDS基因,分别命名为NtHDSY和NtHDSJ,测序结果表明,NtHDSY和NtHDSJ基因全长分别为2 592 bp和2 599 bp,2个基因均含有1个2 178 bp的开放阅读框（ORF）,编码745个氨基酸。同源性分析表明,黄花水仙2号与金盏银台、铁皮石斛、长春花、大豆、葡萄和苹果的相似系数分别为：97.77％、79.29％、75.29％、75.51％、75.02％和74.40％。Real-time PCR分析表明：NtHDS基因在花瓣和副冠内的表达量在开花过程的花蕾期与盛花期存在明显差异,推测该基因可能与多花水仙香气物质的合成有关。     

中国水仙NtMYB1基因的克隆及表达分析

为研究调控花青素合成机制,利用RT-PCR和RACE技术从中国水仙‘金盏银台’（Narcissus tazetta var. chinensis‘Jinzhan Yintai’.）的花瓣和副冠中克隆得到一个MYB基因的cDNA序列,命名为NtMYB1,在GeneBank上登录号为KC763973。序列分析表明,NtMYB1基因全长842 bp,其中开放阅读框长681 bp,编码226个氨基酸,推测的蛋白分子量为25.2 ku,理论等电点为7.94。NtMYB1具有明显的R2R3-MYB结构域,且在R3结构域的下游含有一个相对保守的PDLNLDLSIG氨基酸基序。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与陆地棉、甜樱桃的MYB蛋白相似性分别达到65％和63％。利用实时荧光定量PCR技术检测NtMYB1基因在中国水仙花不同发育时期和部位的表达水平,分析结果表明,NMYB1基因在中国水仙成花不同时期均有表达,但表达量具有明显差异,其中NtMYB1基因在花蕾期的相对表达量约为花苞期的40倍,且其表达量在花瓣要高于副冠。推测NtMYB1可能参与调控花青素合成基因的转录沉默。     

漳州水仙花瓣和副冠类胡萝卜素成分分析及合成途径基因表达研究

采用高效液相色谱（HPLC）分析漳州水仙‘金盏银台’花瓣和副冠中主要类胡萝卜素成分。结果显示,黄色副冠的主要色素成分是叶黄素,含量为3.73×104 μg/g ,β-胡萝卜素的含量很低,仅2.7 μg/g;白色花瓣中各种类胡萝卜素的含量都极低。同时,采用RT-PCR方法分析类胡萝卜素合成途径结构基因PSY、PDS、ZDS、LYCE、LYCB、BCH在‘金盏银台’白色花瓣、黄色副冠,洋水仙‘粉红魅力’白色花瓣、红色花副冠,洋水仙‘嘹亮’黄色花瓣、橙黄色副冠中的表达情况。结果表明,花瓣与同一品种副冠间结构基因     

多花水仙WRKY转录因子的克隆与序列分析

以‘黄花水仙2号’和‘金盏银台’为材料,根据课题组已克隆出的多花水仙转录因子WRKY基因片段设计特异引物,通过RACE技术分别从2个水仙品种中克隆出2个不同的WRKY基因,命名为Nt WRKY40a和Nt WRKY40b,开放阅读框(ORF)长度分别为945和951个碱基。序列分析结果表明,两序列均含有WRKYGQK保守结构域;‘黄花水仙2号’与‘金盏银台’、拟南芥、葡萄、青蒿、小麦和粳稻的相似系数分别为:97.27%、45%、43%、47%、41%和43%。Real-time PCR分析结果表明:WRKY基因在花瓣和副冠开花过程中的表达量发生变化,说明其可能参与多花水仙花朵的衰老过程。     

多花水仙花期类胡萝卜素物质和类黄酮物质的含量变化

为了解多花水仙在开花过程中色素物质含量的变化,以多花水仙‘金盏银台’和‘黄花水仙2号’4个花期副冠和花被为材料,采用高效液相色谱法(HPLC)测定2种类胡萝卜素物质和11种类黄酮物质的含量.结果表明:多花水仙在花蕾期已经有大量色素物质积累;黄花水仙2号主要色素物质是芦丁和叶黄素,金盏银台的主要色素物质是芦丁、柚皮苷、阿魏酸和叶黄素;花期2个品种副冠和花被中芦丁、柚皮苷和阿魏酸的含量变化趋势基本一致,均表现为花蕾期含量最高,始花期、盛花期有所降低,衰败期又升高的趋势,而叶黄素含量变化不尽相同;经t测验分析,花期不同品种同一部位中芦丁、柚皮苷、阿魏酸和叶黄素的含量差异显著,同一品种不同部位中叶黄素和阿魏酸的含量差异显著,芦丁、柚皮苷的含量差异不显著.     

水杨酸对雕刻水仙观赏性状的影响

为进一步验证最适水杨酸浓度能提高中国水仙观赏性。 以中国水仙 ‘金盏银台’ 为材料, 研究不同浓度的水杨酸溶液对雕刻水仙观赏性状的影响。 结果表明： 雕刻水仙在水杨酸喷雾处理诱导下株型紧凑、 叶片直挺、提高开花率, 可避免出现藏花现象从而提高了观赏价值, 其中浓度为 3 mmol/L 时效果较好。     

中国水仙NtBCH基因的克隆及LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建

参考洋水仙BCH基因设计引物，以中国水仙花瓣cDNA为模板克隆出中国水仙NtBCH基因，全长959 bp，编码303个氨基酸。以中国水仙LCYE和BCH为目的基因，利用pKANNBIAL、pBI121和pCAMBIA1301等载体构建了LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体，为利用基因工程技术改良中国水仙奠定了基础。     

‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

本研究利用RT-PCR技术从‘云香’水仙的根中克隆得到了NtNAC1基因,并通过qRT-PCR技术分析了该基因的时空表达模式以及在逆境和逆境相关激素处理下的表达变化,结合分析过表达该基因的转基因烟草植株的表现等解析了该基因的功能。结果显示:NtNAC1基因全长1083 bp,其ORF为918 bp,编码306个氨基酸,N端含有NAM保守结构域,聚分在SNAC1亚组,与香蕉MusaSNAC1、小麦TaNAC47亲缘关系较近。实时荧光定量分析显示,NtNAC1的表达水平随花器官花瓣和副冠的发育呈先上升后下降趋势,始花期达到峰值;NtNAC1在根和叶中高表达,受ABA、MeJA、SA、H_2O_2、NaCl、PEG诱导上调,推测该基因可能参与‘云香’水仙花器官的形态建成及响应非生物胁迫。进一步构建表达载体转化烟草,获得9株转基因植株。在高盐和干旱胁迫处理下,转基因植株根系发达、长势更好、存活率高,表明水仙NtNAC1过表达能提高烟草对高盐、干旱的耐受性,在抗逆中起正向调控作用,可作为提高水仙抗性的优良遗传基因资源。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

果蔗Hsp90基因的电子克隆及序列分析

以克隆到的果蔗HSP90基因片段作为探针,利用电子克隆和序列拼接方法获得一个全长为2 097 bp的cDNA序列.通过ORF软件分析.预测得到的蛋白质具有698个氨基酸.应用生物信息学对果蔗HSP90蛋白的理化性质、二级结构、疏水性,亲水性、信号肽、功能结构域分析及其蛋白功能、高级结构和同源性进行了预测分析.结果表明,该蛋白的相对分子量为80.2 ku,在N端有一个ATP结合位点,具有内源ATPase活性.序列分析表明,该蛋白可能具有信号转导、转录调控、胁迫应答、生长因子等功能.利用梢腐病病原Gibberella fujikuroi接种果蔗福安叶片,检测到HSP90基因的转录水平逐渐提高.     

椰心叶甲蛹酚氧化酶原cDNA片段的克隆与序列分析

通过RT-PCR,从椰心叶甲蛹总RNA中扩增2个与酚氧化酶基因相关的DNA片段,经克隆,测序得到2个片段的碱基序列,分子量分别为417bp和638bp。同源性比对表明,417bp和638bp片段与黄粉甲原酚氧化酶同属一类;417bp和638bp的cDNA序列比对发现,638bp片段内包含了417bp片段的全序列,同时还存在2个插入序列,这2个插入序列基本都处于编码酚氧化酶氨基酸序列的阅读框之外。     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。     

甘蓝型油菜有、无花瓣近等基因系花器官的比较研究

比较甘蓝型油菜有、无花瓣近等基因系花器官的形态差异，结果表明，无花瓣品系在花蕾、花萼、雌蕊长度上与有花瓣品系无差异，仅雄蕊长度有所下降；无花瓣品系因缺少花瓣，花蕾重量仅为有花瓣品系的55．89％，但花萼、雄蕊、雌蕊重量差异不大，其中花萼和雄蕊重量略有下降，而雌蕊重量则上升。无花瓣品系花器官各部分与有花瓣品系间的差异主要表现在花瓣缺失上，而花萼、雄蕊、雌蕊、花粉、柱头和蜜腺等形态均无明显差异，因此，该油菜花瓣缺失类型可能与拟南芥等植物花器官发育的ABC模型不符。     

玉米螟虫生真菌球孢白僵菌几丁酶基因的克隆与分析

球孢白僵菌是最常见的昆虫病原真菌之一,已成功应用于玉米螟和松毛虫等害虫的生物防治。球孢白僵菌主要通过分泌多种胞外水解酶降解昆虫体壁侵入寄主,其分泌的水解酶主要包括蛋白酶、几丁质酶、脂酶等。本研究从玉米螟虫生真菌球孢白僵菌中分离到一个几丁质酶基因BbChitI,该基因的编码区包含1047bp,编码了348个氨基酸,氨基酸序列与来源于小菜蛾虫生真菌的白僵菌几丁质酶的同源性高达99%,与来源于木霉菌的几丁质酶的同源性达到82%。     

香蕉MaTPS4基因序列及表达特性分析

通过随机克隆测序法从香蕉根系c DNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS4,全长c DNA序列为2 930 bp,含一个完整的开放阅读框2 574 bp,编码857个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS4蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,pI5.59,结构域TPS和TPP。序列预测分析表明,MaTPS4蛋白定位于细胞质中,具有3个跨膜区域,不存在信号肽。与其他已知植物TPS氨基酸序列同源比对,同源性达到84.90%;进化关系分析表明,香蕉MaTPS4氨基酸与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)聚为一类,二者亲缘关系较近,同源性为99%。器官特异性分析表明,MaTPS4在香蕉根系、球茎、假茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中球茎、假茎、叶片和花中表达量较大,根及果实中表达量极少。q RT-PCR分析表明,MaTPS4在根系中的表达经干旱、盐胁迫后均增强,其中盐胁迫24 h时MaTPS4表达量较0 h时高5倍;冷胁迫下,MaTPS4表达量增加,并随时间延长下降,在6 h达到最大;ABA胁迫下,MaTPS4表达量增加,为0 h的5倍;在ACC和Foc TR4胁迫下,MaTPS4表达无变化。因此,MaTPS4可能通过依赖ABA途径调控抗逆胁迫相关基因表达,提高植株对非生物胁迫的抗逆性。