拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶启动子在转基因烟草中的表达特性分析

通过对报告基因GUS产物的分析进行了拟南芥2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT)启动子在转基因烟草中的表达特性的初步研究。构建含该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化烟草,对转基因烟草进行GUS组织化学染色和GUS荧光定量分析该启动子表达特性。GUS在转基因烟草的根和种子中基本不表达,茎上有一定表达,叶上表达量最高,约是茎的4.7～10.9倍。结果表明MPBQMT基因启动子主要在烟草绿色组织中特异性高表达。     

甘蓝SLR1启动子在烟草及芥菜中的表达分析

为研究甘蓝SLR1启动子在异源植物中的表达特点,将GUS报告基因在1.5kb长的SLR1启动子驱动下,通过农杆菌介导法分别导入烟草和芥菜.转基因植株经PCR鉴定显示GUS报告基因已经整合到烟草和芥菜基因组中.转基因植株开花后花器官组织的GUS化学染色分析结果显示SLR1启动子主要在烟草和芥菜开花前2天至开花后的柱头中大量表达,部分转基因烟草植株开花后的花冠,转基因芥菜植株花萼、花瓣及花丝中也有明显的表达,但在两种转基因植株花粉中均未检测到GUS表达活性,显示甘蓝SLR1启动子在异源植物中不是一个严谨的柱头特异启动子.     

SV40启动子在烟草体内的驱动特性研究

根据SV40启动子序列设计引物,PCR扩增该启动子后,成功构建了具有SV40启动子和GUS报告基因的植物表达载体pLpPSG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过SV40启动子驱动的GUS基因在烟草叶片内的瞬时性表达,研究了该启动子在植物基因表达中的驱动特性.结果表明:SV40启动子可启动GUS基因在烟草体内的表达,其提高基因表达水平达到2×35S启动子的(88.5±19.2)%.     

银杏木质部特异定位表达基因启动子在转基因烟草的功能研究

为了研究银杏GRP 1.8启动子在木本植物中的调控制特性,用从银杏细胞壁形成及纤维素生物合成密切相关的,并定位于形成层木质部维管组织细胞表达的富甘氨酸蛋白质基因(GRP 1.8)的启动子与GUS报告基因构建的表达载体转化烟草,经过Southern blotting鉴定,得到一批转化再生植株.经GUS组织化学检测,发现转基因烟草的茎木质部呈现GUS染色阳性,初步证明银杏GRP 1.8基因启动子确有韧皮部表达特性,可介导GUS基因在转基因烟草木质部特异性表达.     

小麦avenin-like type-B基因启动子的克隆及功能验证

为深入研究ALPtype-B基因的调控机理及胚胎特异性表达特性,采用农杆菌转化技术,将含有ALPtype-B基因启动子的双元表达载体转化烟草。对阳性转基因烟草植株进行GUS组织化学检测定性分析。结果显示,小麦ALPtype-B基因启动子可驱动报告基因在烟草种子的胚乳中特异表达,在其他组织中没有表达。     

根结线虫诱导巨型细胞形成关键启动子的定位

为了找到根结线虫诱导的烟草根结内特异性强启动的启动子和了解巨型细胞被诱导形成的分子机理,用无启动子的报告基因(GUS)及旁边的Ds转座子,分离烟草根结内巨型细胞特意启动子.将p13DGUTs转烟草叶片,获得了转基因植株.通过根结线虫感染盆载转基因烟草后,分别检测根系、叶的报告基因的表达情况.结果显示,从转基因植株中筛选到只在根结巨型细胞内表达的转基因植株.     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

CaKR1上游启动子分离及其表达分析

运用基因组步移技术分离获得了CaKR1基因上游-1594 bp的启动子序列,命名为CaKR1p,发现其中含有SA、ABA、低温等信号应答原件以及其它诸如W盒等应答逆境胁迫的调控原件。进一步构建CaKR1p与GUS报告基因融合的植物表达载体,获得了烟草转基因植株及其相应的T1代株系,利用T1代转基因株系分析了CaKR1p在几种外源激素处理下的GUS基因的表达,结果表明外源激素SA、JA和ABA的诱导处理均可激活该启动子下游报告基因GUS的表达,说明CaKR1的表达和作用受到SA、ABA以及JA等信号通路调节。     

橡胶树HbHMGS1启动子对光照、干旱及热击处理的表达响应

克隆了橡胶树HbHMGS1基因上游长1 656 bp的启动子序列及其一系列5′缺失片段,并利用PlantCARE启动子预测软件对其进行分析,同时,以GUS基因作为报告基因,构建植物缺失表达载体并通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥,并对GUS蛋白的表达活性进行定性及定量检测分析。结果表明:该启动子能够在烟草叶片和T2代转基因拟南芥植株幼苗时期及成熟期不同组织器官中驱动下游GUS基因的表达,且叶片染色呈现明显的蓝色。将包含有HbHMGS1启动子的转基因拟南芥苗进行光周期处理发现,GUS蛋白活性在光照96 h处理时瞬间增大到处理72 h时的3.2倍,黑暗条件下处理72,96 h后叶片GUS活性也显著增加,分别是处理48 h时GUS活性的1.38和2.13倍。通过定量检测HbHMGS1启动子及其各缺失启动子响应热击及干旱处理的GUS蛋白活性发现,-699到起始密码子-1处的699 bp序列可能是主要的热击响应区域;干旱响应区域则主要位于-213到起始密码子-1处的213 bp序列中。结果表明,HbHMGS1启动子在调控HbHMGS1基因响应光照、热击及干旱诱导表达方面起到重要作用。     

棉花γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与序列分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是植物维生素E生物合成途径中的关键酶.通过RACE-PCR得到了棉花γ-TMT基因的cDNA序列,全长1384 bp,包含一个长为1 035bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与番茄、大豆、拟南芥、向日葵、玉米等植物的γ-生育酚甲基转移酶基因编码的氨基酸序列的同源性较高,序列的一致率为68%～81%;与莱茵衣藻的序列同源性较低,一致率只有54%.系统进化分析结果表明不同来源的γ-TMT基因聚为3类.     

水稻γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是植物维生素E生物合成途径中的关键酶.通过RACE-PCR得到了水稻γ-TMT基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 432 bp,包含一个长为1 089 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦、玉米、向日葵、番茄、大豆、拟南芥的γ-生育酚甲基转移酶基因的同源性分别为90%、87%、76%、75%、74%、70%.     

拟南芥HPT1,VTE3及VTE4基因启动子在逆境条件下的表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性维生素,具有重要的生理功能.尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)、2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMT/VTE3)、γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT/VTE4)是维生素E生物合成途径中的关键酶.本研究对来自拟南芥的HPT1,VTE3,VTE4三个基因启动子在低温、高盐及无光等逆境条件下的表达特性进行了分析,GUS组织化学染色结果表明:低温条件下,HPT1的表达降低明显,高盐条件下,HPT1的表达仅略有降低,无光条件下HPTl在茎中的表达升高,而根中的表达则降低;低温条件下VTE3的表达没有变化,高盐条件下则明显降低,无光条件下VTE3在茎中的表达显著降低;低温条件下VTE4表达略有升高,高盐条件下其表达明显降低,无光条件下VTE4在茎中的表达有所降低.说明拟南芥维生素E合成途径中的酶的表达受外界环境条件的影响.     

葡萄VvAGL17.2启动子活性与GA3低温胁迫的调节作用关系

本文通过PCR技术从葡萄品种黑比诺基因组中克隆到的葡萄启动子,命名为VvAGL17.2。本试验利用启动子VvAGL17.2构建报告基因GUS的植物表达载体,利用农杆菌浸染法转化植物,获得转基因拟南芥和烟草,从而研究该启动子在拟南芥和烟草中的表达活性及对低温胁迫和赤霉素处理的响应方式。试验结果表明,在9d苗龄的转基因拟南芥植株中,GA3处理上调了莲座叶中VvAGL17.2启动子的活性,而低温处理下调了莲座叶中VvAGL17.2启动子的活性。对瞬时转化的烟草叶片进行GUS染色,结果表明该启动子具有启动活性,且GA3处理下增强了该启动子的表达活性,而低温处理下减弱了VvAGL17.2启动子活性。研究表明启动子VvAGL17.2是一个受低温抑制表达,受赤霉素诱导表达的启动子。该启动子可应用于植物抗逆基因研究或抗逆基因工程育种。     

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆与功能分析

从拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA中扩增出热激启动子AtH-SP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子AtHSP70b插入到pSAU2008的gus基因及NOS终止子上游,构成热激启动子控制GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入到pVCT2020中得到表达载体pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,并转化烟草(W38)获得再生植株,通过PCR检测鉴定,表明“AtH-SP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。     

葡萄VvAGL17.2启动子活性与GA_3和低温胁迫的调节作用关系

应用PCR技术从葡萄品种黑比诺基因组中克隆到葡萄启动子,并命名为VvAGL17.2。本试验利用启动子VvAGL17.2构建报告基因GUS的植物表达载体,利用农杆菌浸染法转化植物,获得转基因拟南芥和烟草,从而研究该启动子在拟南芥和烟草中的表达活性及对低温胁迫和赤霉素处理的响应方式。结果表明,在苗龄9 d的转基因拟南芥植株中,赤霉素(GA_3)处理上调了莲座叶中VvAGL17.2启动子的活性,而低温处理下调了莲座叶中VvAGL17.2启动子的活性。对瞬时转化的烟草叶片进行GUS染色表明,该启动子具有启动活性,且GA_3处理下增强了该启动子的表达活性,而低温处理下减弱了VvAGL17.2启动子活性。由此表明,VvAGL17.2是一个受低温抑制表达、受赤霉素诱导表达的启动子,可应用于植物抗逆基因研究或抗逆基因工程育种。     

拟南芥AtRD29a启动子在烟草中的表达特性

将低温诱导启动子AtRD29a控制的GUS基因转入烟草,通过GUS活性组织染色,分析拟南芥AtRD29a启动子在烟草植株中的表达特性;结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,并且AtRD29a启动子在烟草中同在拟南芥中一样,不具有组织表达特异性,而是低温诱导型启动子;它在25 ℃常温下不表达,10 ℃左右为诱导临界温度,4 ℃左右稳定和高效表达.     

水稻糖基水解酶基因GH27启动子克隆及初步分析

通过生物信息学方法找到水稻中与拟南芥β-葡糖苷酶类基因同源的糖基水解酶基因GH27.Northern检测结果显示该基因在衰老晚期的叶片中高量表达.利用PCR技术克隆GH27基因的启动子(PGH27)序列,构建启动子PGH27与报告基因GUS融合基因的表达载体PGH27:GUS,并通过农杆菌介导法转化水稻品种中花11,GUS染色结果表明该启动子PGH27可以有效地驱动GUS基因在转基因愈伤组织和水稻植株老叶中表达.     

玉米γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]对玉米γ-生育酚甲基转移酶（γ-TMT）基因进行克隆和分析研究。[方法]通过RT-PCR扩增得到玉米γ-TMT基因的cDNA序列,同时对序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统进化分析。[结果]玉米γ-TMT基因cDNA全长1 310 bp,包含一个长为1 059bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦和水稻等高等植物的γ-TMT基因同源性较高,序列一致率为69%～87%;与低等生物褐藻的序列同源性较低,一致率只有56%。系统进化分析表明不同来源的γ-TMT基因可聚为3类。[结论]为进一步研究γ-TMT基因的功能奠定了基础。